יישום של סינון אולטרה בייצור חיסון נגד כלבת אנושי

על מנת לקדם את היישום של סינון אולטרה בייצור חיסון נגד כלבת אנושי, נעשה שימוש בקלטת ממברנת אולטרה סינון בנפח 300kDa לריכוז תמיסת קציר נגיף הכלבת וזיהוי התאוששות האנטיגן, קצב הסרת האנדוטוקסינים וקצב הסרת החלבון המארח לאחר אולטרה סינון. התוצאות הראו שתחת הלחץ המתאים, תמיסת קציר נגיף הכלבת רוכזה 80 פעמים, נפלטה 25 פעמים, שיעור התאוששות האנטיגן היה 86.2%, שיעור הסרת האנדוטוקסין החיידקי היה 87.5% ~ 88.7%, ו שיעור הסרת החלבון המארח היה 91.6%.

 

הַקדָמָה

 

כלבת היא מחלה זואונוטית מסורתית ועתיקת יומין הנגרמת על ידי נגיף הכלבת (RV), עם שיעור תמותה של עד 100%. כיום אין טיפול יעיל לאחר חשיפה (כלומר פגיעה בעור ובריריות) מלבד חיסון חירום וחיסון אימונוגלובולינים. המקור העיקרי לכלבת בבני אדם הוא עקיצות של בעלי חיים חולים או בעלי פוטנציאל נגוע (בעיקר כלבים). שיעור התמותה של כלבת בסין נמצא במקום השני בעולם, וכלבת היא אחת הבעיות המאיימות על ביטחון בריאות הציבור בארצנו. הגליקופרוטאין הקפסולרי של נגיף הכלבת, שהוא האנטיגן המפתח היחיד שגורם לייצור של נוגדן מנטרל מגן, עמד במוקד המחקר והפיתוח של חיסונים חדשים וטכנולוגיות אבחון וטיפול חדשות של נגיף הכלבת.

 

נגיף הכלבת שייך לסוג נגיף הכלבת ממשפחת הרבדוווירוסים. צורת הנוקלאוקפסיד אלסטית, הנוקלאוקפסיד סימטרי סליל, ולפני השטח יש מעטפה המכילה RNA חד-גדילי. זה הפתוגן שגורם לכלבת. לנגיף הכלבת יש שני אנטיגנים עיקריים: האחד הוא אנטיגן הגליקופרוטאין על הממברנה החיצונית של הנגיף, שיכול להיקשר לקולטן לאצטילכולין כדי להפוך את הנגיף לנוירוטוקסי, ולייצר נוגדנים מנטרלים ונוגדנים מעכבי המגלוטינציה בגוף, והנוגדנים המנטרלים יש אפקט מגן; השני הוא אנטיגן הריבופרוטאינים הפנימי, שיכול לגרום לגוף לייצר נוגדנים קושרי משלים ופריפיטין, ואין לו השפעה מגינה.

 

אנדוטוקסין הוא מעין חומר ליפופוליסכריד (LPS), בעל עמידות בחום ויציבות כימית ולא קל להרוס אותו. אם יש ריכוז מסוים של אנדוטוקסין בחיסון, הוא יגרום לחום חמור ואף למוות לאחר החיסון, ולכן יש להפחית ככל האפשר את תכולת האנדוטוקסין בחיסון. מהדורת 2005 של הפרמקופיה הסינית (חלק III) קבעה שערך הבקרה של המדד המותאם של אנדוטוקסין חיסון כלבת לא צריך להיות גבוה מ-100EU/מנה. עם ההתפתחות המהירה של טכנולוגיית הפרדת ממברנות, היישום של טכנולוגיית הפרדת ממברנות אולטרה-פילטרציה להפחתת תכולת האנדוטוקסין בחיסונים הופך יותר ויותר נרחב בתעשיית התרופות.

 

חיסון נגד כלבת הוא חיסון נגד כלבת. בדרך כלל ישנם שלושה סוגים של חיסוני כלבת, כולל חיסון תאי Vero מטוהרים, חיסון תאי דיפלואיד אנושי וחיסון תרבית תאים ראשוני. חיסון נגד כלבת נעשה על ידי חיסון וירוס קבוע של וירוס הכלבת לתוך המטריצה ​​התאית, לאחר תרבית, קציר, ריכוז, ביטול, טיהור והוספת מייצב מתאים. תפקידו העיקרי של חיסון נגד כלבת הוא לעורר את הגוף לייצר תגובה חיסונית מהירה ולייצר נוגדנים מגנים נגד נגיף הכלבת, על מנת למנוע זיהום הנגרם על ידי הנגיף ולהפחית את הסיכון למחלות.

 

 

לתהליך הייצור של החיסון תפקיד חשוב בהבטחת איכות החיסון, במיוחד הכימות של כמה מדדים בתהליך הייצור חשוב יותר. בתהליך הייצור של חיסון נגד כלבת אנושי, טכנולוגיית ריכוז אולטרה סינון היא אמצעי הכרחי לייצור חיסון נגד כלבת אנושי. שימוש בממברנת אולטרה סינון עם צמצם סביר לריכוז אולטרה סינון יכול להסיר ביעילות אנדוטוקסין וחלבון מארח, ולשמור על אנטיגן RV, אשר תורם לייצור חיסונים ולשיפור האיכות. המסה המולקולרית היחסית של מולקולות RV היא 350kDa ~ 460kDa, ובתיאוריה, ניתן ללכוד RV לחלוטין על ידי ריכוז אולטרה סינון באמצעות קלטת ממברנה עם משקל מולקולרי יירוט של 100kDa ו-300kDa. אנדוטוקסין יוצר לעתים קרובות מבנה מצטבר בתמיסות מימיות שונות, בגלל מידת הצבירה, הגודל המולקולרי שונה. המסה המולקולרית היחסית של מונומר אנדוטוקסין היא 10kDa ~ 20kDa, והמסה המולקולרית היחסית של צורת הפילמור שלו היא 300kDa ~ 1000kDa או יותר מ-1000kDa. בהתבסס על ההבדל במשקל המולקולרי, האנטיגן RV בחיסון נגד כלבת אנושי נשמר והאנדוטוקסין וחלבון המארח בחיסון נגד כלבת אנושי הוסרו על ידי קרום סינון אולטרה-פילטרני של 300kDa.

 

בניסוי זה, קלטת ממברנות אולטרה סינון עם צמצם של 300kDa ושטח ממברנה של 0.11m2 שימשה כטיפול מדגם קטן לריכוז מוצרי ביניים של חיסון כלבת אנושי, ושטף ממברנה, יעילות טיפול, ריבוי ריכוז, יירוט אנטיגן, הסרת אנדוטוקסינים , והסרת חלבון המארח נבדקו.

 

2שיטת חומר

 

2.1 חומרים ניסיוניים

זן CTN-IV של וירוס נגיף הכלבת; תאי Vero; 0.5M נתרן הידרוקסיד; 300kDa קלטת קרום סינון אולטרה (חומר PES, שטח ממברנה של 0.11 מ"ר).

 

2.2 שיטות ניסוי

2.2.1 הכנת תמיסת קצירת וירוסים

תאי Vero קפואים בוצעו החייאה במים חמים ב-37 מעלות ~ 39 מעלות, תרחיף תאים נלגם החוצה, ולאחר מכן הוספו ל-199 מצע תרבות המכיל 10% סרום עגל מומת. תאים חד-שכבתיים אחידים תורבו ב-37 מעלות. זן ה-CTN-IV חוסן בנגיף כלבת ביחס של 0.1mol/L ותורבת ב-37 מעלות. לאחר 48 שעות, מצע התרבית הושלך ונוספו 199 מצע תרבות המכיל 0.1% אלבומין בדם אנושי כדי לשמור על התרבית ב-33 מעלות ~ 35 מעלות. קצור את ארס המחלה אחת ל-3 ימים-5 ושלב את נוזלי הקציר המרובים.

 

2.2.2 התקנת קלטת הממברנה

התקן את קלטת הממברנה וחבר את החיווט כפי שמוצג באיור למטה.

 

2.2.3 שטיפת מים

סגור את שסתום הכניסה, שסתום החזרה ודרך השסתום, והכנס את קצה החזרה וצינור הקצה לתוך מיכל נוזל הפסולת. מלאו את מיכל היניקה ב-1 ליטר מים להזרקה.

פתח את שסתומי הכניסה והחזרה, סגור את שסתומי הכניסה, פתח את המשאבה, נקה את קו ההחזרה עם 10% נפח של מים מטוהרים או מים להזרקה, ושמור על לחץ הכניסה ב-0.35bar (5psi).

פתח את שסתום המסנן, סגור את שסתום ההחזרה והשתמש במי ההזרקה הנותרים כדי לנקות את צינור המסנן, תוך שמירה על TMP ב-0.35bar.

 

2.2.4 חיטוי

סגור את שסתום הכניסה, שסתום ההחזר ושסתום ההילוכים, והכנס את קצה ההחזר וקווי קצה ההילוכים לתוך מיכל נוזל הפסולת. מלא את מיכל היניקה ב-2 ליטר תמיסת ניקוי.

פתחו את שסתומי הכניסה והחזרה, סגרו את שסתומי הכניסה, פתחו את המשאבה, נקו את קו ההחזרה עם 200mL של 0.5M נתרן הידרוקסיד, ושמרו על לחץ הכניסה ב-0.35bar (5psi) .

פתח את השסתום המעבר, סגור את שסתום ההחזרה ונקה את הצינור העובר עם נפח של 200 מ"ל של תמיסת ניקוי, תוך שמירה על TMP ב-0.35bar.

לאחר מכן מכניסים את קצה החזרה וצינור הקצה אל מיכל הנוזל לניקוי מחזורי. מחזור ניקוי עם פי 1 ~ 1.5 מקצב הזרימה המשיקית של התהליך למשך 30 דקות.

רוקן 0.5M של נתרן הידרוקסיד ושטוף במים להזרקה לפי 2.2.4 עד לנייטרלי.

 

2.2.5 בדיקת שטף מים

הוסף מים מטוהרים למיכל היניקה, מדוד ורשום את טמפרטורת המים במיכל היניקה. הכנס את הקצה המחזיר לתוך המיכל. הפעל את המשאבה והתאם את מהירות המשאבה ושסתום ההחזרה כדי להשיג הפרש לחץ טרנסממברני של 0.35bar (5psi). בעזרת גליל, מדוד ורשום את קצב הזרימה בקצה המעבר במילימטר לדקה. כוונן את מהירות המשאבה ואת שסתום ההחזרה כדי לקבל 1בר (15psi) הפרש לחץ טרנסממברני. בעזרת גליל, מדוד ורשום את קצב הזרימה בקצה המעבר במילימטר לדקה.

כדי לתקן את ערך זרימת המים, חלקו את ערך זרימת המים המחושב בהפרש הלחץ הטרנסממברני והכפילו את מקדם תיקון הטמפרטורה בטבלה הבאה.

 

2.2.6 ריכוז אולטרה סינון

שטפו את המים מהמערכת עם החלק העליון של החיץ. מחזור במשך 5 דקות כדי להתאים את ה-pH ויציבות היונים של המערכת. אם יש צורך להתאים את הטמפרטורה, המשך במחזור עד שטמפרטורת המערכת תהיה יציבה.

הוסף את נוזל ההזנה למיכל היניקה, הגדר קצב זרימת הזנה (למשל 400LMH), ובדוק את קצב הזרימה בערכי TMP שונים. על פי נתוני הבדיקה, עקומות שורטטו עם TMP כאבססיס ו-Flux כאורידינטה.

יש לכוון את הצינור העובר לתוך מיכל או ניקוז מתאים, כגון מיכלי איסוף דרך קצה, מיכלי נוזלי פסולת וניקוז תהליכים.

רשום את המשקל הראשוני של נוזל ההזנה במיכל ההזנה, הפעל את משאבת ההזנה, והפיץ באיטיות את נוזל ההזנה למשך 3 דקות עד 4 דקות. מחזור חוזר יכול לעזור להסיר את שאריות האוויר בנתיב הזרימה, ובכך למקסם את הביצועים של הסרט.

פתח את שסתום המעבר, הגבר באיטיות את מהירות המשאבה עד הגעה לקצב הזרימה המשיקית האופטימלית, והתאם את שסתום ההחזרה כדי להשיג את ה-TMP האופטימלי של המערכת.

לאחר מכן הכניסו את הצינור למיכל האיסוף, התחילו לתזמן מתי הנוזל נכנס למיכל, ורשמו את לחץ הכניסה והחזרה במרווחים מתאימים, ורשמו את איכות הנוזל לאורך זמן בקצה ההחזרה ובקצה המעבר כדי לחשב את המיידי קצב זרימה.

ריכוז האולטרה סינון של הדגימה הושלם כאשר נפח הנוזל של ההזנה מצטמצם לנפח ריכוז המטרה.

 

2.2.7 דיאליזה

הכנס את צינור היניקה, צינור החידוש וצינור ההחזרה לתוך מיכל היניקה, הכנס את צינור ההולכה לתוך מיכל האיסוף, והנח את מיכל האיסוף על המאזן כדי לפנות אותו.

פתח את שסתום ההחזרה, הפעל את משאבת הכניסה, פתח את שסתום המעבר, כוונן את מהירות המשאבה וה-TMP לערך המתאים. פתח את משאבת המילוי, השאר את נפח הנוזל במיכל היניקה ללא שינוי, והתחל בדיאליזה בנפח שווה. התחל לתזמן מתי הנוזל נכנס למיכל, ורשום את הלחץ בקצה הכניסה, בקצה ההחזרה ומסת הנוזל במרווח הזמן המתאים, וקבל את קצב הזרימה המיידי בחישוב.

 

2.2.8 CIP

תחילה יש לשטוף במאגר, לאחר מכן לשטוף במים להזרקה (פעולה 2.2.3), לאחר מכן לנקות בחומר ניקוי (פעולה 2.2.4), ולבסוף לשטוף במים להזרקה (פעולה 2.2.3).

 

2.2.9 בדיקת שטף מים

הפעולה היא כדלקמן: 2.4.5.

 

2.2.10 שימור קלטת ממברנה

אחסון לטווח קצר (פחות או שווה ל-3 ימים), שמור את קלטת הממברנה במתקן והשתמש בתמיסת האחסון למחזור של 10 דקות עד 15 דקות, סגור את שסתום המערכת, מנתק את אספקת החשמל למשאבת הנוזל, והבטח שמיכל כניסת הנוזל אטום כהלכה.

אם זמן האחסון הוא 3 ימים עד חודש, אנא הסר את קלטת הממברנה מהמתקן ואטום אותה לתוך שקית ניילון או מיכל אטום אחר. הוסף כ-50 מ"ל עד 100 מ"ל מתמיסת האחסון לשקית ניילון או לכלי אטום ואטום אותו. או שניתן לטבול אותו ישירות בפתרון האחסון. הטבלה הבאה ממליצה על תנאי אחסון.

 

3 תוצאות וניתוח

 

3.1 חקירת גורמי השפעה של יעילות סילוק פירוגן

לחץ פעולת סינון אולטרה: 15 קבוצות בדיקה הופעלו ברציפות. בכל אצווה, לחץ הסינון נשמר על 5, 10, 15 ו-2{{10}}psi במהלך סינון האולטרה, ונוזל קציר הנגיפים רוכז 30 פעמים ונפלט עם נוזל חיץ (פי 10 מהנפח) בזרימה רציפה. התוצאות כפי שמוצגות בטבלה למטה, שיעור ההסרה של אנדוטוקסין היה נמוך מ-87.0%, שיעור ההחלמה של האנטיגן היה יציב ב-86.0%, ושיעור ההסרה של חלבון המארח היה יציב ב-90.0%, מה שמצביע על כך. שללחצים הפעלה שונים הייתה השפעה מועטה על ההשפעה של התאוששות אנטיגן, הסרת אנדוטוקסינים והסרת חלבון המארח.

יחס ריכוז אולטרה סינון: 15 קבוצות בדיקה הופעלו ברציפות. בכל אצווה, נוזל קציר הנגיפים רוכז 30 פעמים, 50 פעמים, 80 פעמים ו-100 פעמים בהתאמה במהלך סינון האולטרה. לחץ הסינון נשמר על 20psi, ונוזל החיץ (פי 10 מהנפח) נשלף בזרימה רציפה. התוצאות כפי שמוצגות בטבלה הבאה, שיעור ההסרה של אנדוטוקסין נע בין 53.3% ל-86.9%, שיעור התאוששות האנטיגן נשאר יציב על 86.0%, ושיעור ההסרה של חלבון המארח היה יציב ברמה של 91.0%. בדגימה מפולחת, לא זוהה אנטיגן בתמיסת ההעברה, ופחות מ-10% מהחלבון המארח נשאר בתמיסת הנגיף המרוכזת. ריכוז האנדוטוקסין בתמיסה המרוכזת של הנגיף עלה עם עליית זמני הריכוז, וקצב סילוק האנדוטוקסין היה הגבוה ביותר בדגימה המרוכזת של פי 80, והיצרן יכול היה לשקול גם את הריכוז של פי 100, מה שלא רק שיפר את יעילות הייצור והפחית את העלות, אך גם עמד בדרישות של ייצור חיסונים.

 

3.2 דלדול שטף קלטת ממברנה והתחדשות ניקוי

לאחר הטיפול, שיעור התאוששות שטף הממברנה היה 92.6%. קצב ההתאוששות הראשון של קלטת הממברנה החדשה הוא תקין, על פי תכונות התצפית הנוכחיות של נוזל ההזנה, החיזוי שלאחר מכן של הפעמים השניות וה-NTH, קצב שחזור שטף קלטת הממברנה יהיה קרוב לנתונים לאחר טיפול זה, וכן נוטים להיות יציבים. תוך שעתיים משימוש חד פעמי, דלדול קלטת הממברנה היה אידיאלי, ורק 10% משטף הממברנה התרוקן בפעולה הכוללת.

3.2.1 דלדול שטף בתהליך טיפול בקלטת ממברנה

3.2.2 תוצאה של ניקוי והתחדשות קלטת הממברנה

 

לגבי Guidling

 

Guidling Technology הוא מיזם היי-טק לאומי המתמקד בביו-פרמצבטיקה, תרבית תאים, טיהור וריכוז של ביו-רפואה, אבחון ונוזלים תעשייתיים. פיתחנו בהצלחה מכשירי סינון צנטריפוגליים, קלטות אולטרה סינון ומיקרו סינון, מסנן וירוסים, מערכת TFF, מסנן עומק, סיבים חלולים וכו' העונים במלואם על תרחישי היישום של ביו-פרמצבטיקה, תרבית תאים וכן הלאה. הממברנות ומסנני הממברנות שלנו נמצאים בשימוש נרחב בריכוז, מיצוי והפרדה של סינון מקדים, מיקרו-פילטרציה, אולטרה-פילטרציה וננו-סינון. קווי המוצרים הרבים שלנו, החל מסינון מעבדה קטן וחד פעמי ועד למערכות סינון ייצור, בדיקות סטריליות, תסיסה, תרבית תאים ועוד, עונים על צורכי הבדיקה והייצור. Guidling Technology מצפה לשתף פעולה איתך!