יישום שלUסינון פנימהEמיצוי שלNטבעיCאולגן

 

Ⅰ.מהו קולגן

קולגן הוא ביו-פולימר, המרכיב העיקרי ברקמת החיבור של בעלי חיים, וגם החלבון הפונקציונלי הנפוץ והנפוץ ביותר ביונקים, המהווה 25%-30% מסך החלבון, ואף עד יותר מ-80% בחלקם. אורגניזמים. הוא ממלא את התפקיד של קשירת רקמות בתאי בעלי חיים.

על פי המדידה, למבוגר יש כ-3 ק"ג של קולגן בגופו, הקיים בעיקר בעור, עצמות, עיניים, שיניים, גידים, איברים פנימיים (כולל לב, קיבה, מעי וכלי דם) ובחלקים אחרים. של גוף האדם. תפקידו לשמור על המורפולוגיה והמבנה של העור והאיברים, והוא גם חומר גלם חשוב לתיקון רקמות פגועות.

II. מיצוי קולגן מאבנית גראס קרפיון על ידי אולטרה סינון

1. חומרים ושיטות

1.1 דגימות בדיקה

תמצית מימית של קולגן גולמי.

1.2 שיטות בדיקה

1.2.1 תהליך סינון אולטרה

1.2.2 קביעת תהליך הסינון מראש

בבדיקה זו, תהליך הסינון האופטימלי נקבע באמצעות ניתוח השוואתי של שיטת סינון הוואקום ושיטת המיקרופילטרציה. שיטות הבדיקה הספציפיות הן כדלקמן:

① תמצית מימית הקולגן הגולמית מסוננת בשיטת סינון ואקום בנייר פילטר כדי להסיר חלקיקים וזיהומים מרחפים בתמצית המימית.

② תמצית מימית הקולגן הגולמית מסוננת בעזרת ממברנת מיקרו-סינון של 0.2 מיקרומטר כדי להסיר חומרים בלתי מסיסים, זיהומים וכו' בתמצית המימית.

1.2.3 בחירת גודל נקבוביות קרום סינון אולטרה

במהלך הטיהור, גודל הנקבוביות של קרום סינון אולטרה הוא 100 kDa.

1.2.4 ניסוי גורם יחיד של תהליך טיהור אולטרה סינון

התמצית המימית של קולגן גולמי מטוהרת בטכנולוגיית אולטרה סינון. למד את ניסוי הגורם היחיד של השפעת לחץ ההפעלה, טמפרטורת הפעולה וה-pH על שימור הקולגן. לאחר התחלת ציוד האולטרה סינון למשך תקופה, למד את ההשפעה של גורמים שונים על קצב שימור הקולגן.

1.2.5 נוסחת חישוב

2. תוצאות וניתוח

2.1 ניתוח תהליך טרום סינון

ראה את הטבלה שלהלן לתוצאות ההשוואה של שיטת סינון הוואקום ושיטת המיקרופילטרציה.

שיטת סינון	ריכוז תמיסה לפני סינון/(g/L)	ריכוז תמיסה לאחר סינון/(g/L)	תופעות חושיות
שיטת סינון ואקום	0.45	0.35	התמיסה צלולה בתום הסינון, אך נעשית עכורה לאחר שהושארה לפרק זמן.
שיטת מיקרו סינון	0.45	0.42	התמיסה צלולה בתום הסינון ונשארת צלולה לאחר שהותרה לתקופה מסוימת

 

ניתן לראות מהטבלה שגם שיטת סינון הוואקום וגם שיטת המיקרופילטרציה יכולות להסיר את הזיהומים והמוצקים הבלתי מסיסים בתמיסה, אך לשיטת המיקרופילטרציה יש אפקט הגנה טוב יותר על חלבון, כלומר, ההפסד אינו משמעותי, ו שיטת סינון הוואקום עלולה לגרום לאובדן חלבון. בנוסף, התסנין מעונן לאחר שהונחו לתקופה מסויימת על ידי סינון ואקום, בעוד שהמיקרו סינון עדיין צלול ושקוף, ולכן המיקרופילטרציה נבחרה כתהליך טיפול מקדים של סינון אולטרה.

2.2 בדיקת גורם יחיד של תהליך סינון אולטרה

2.2.1 השפעת לחץ אולטרה סינון על קצב ההחזקה

בתנאי של טמפרטורה 40 מעלות ו-pH 9.0, למד את ההשפעות של לחצי סינון אולטרה שונים (0.07MPa, 0.{ {11}}9MPa, 0.11MPa, 0.13MPa ו-0.15MPa) על קצב שימור החלבון. התוצאות מוצגות באיור למטה.

 

כפי שניתן לראות מהאיור לעיל, עם עליית לחץ הפעולה, קצב היירוט של החלבון ירד בהדרגה. ב-{{0}}.07MPa, שיעור החזקת חלבון הוא 96.53%, כאשר לחץ הפעולה הוא 0.15MPa, שיעור שימור החלבון הוא 84.38%. הסיבה לכך היא שהפרדת חומרים על ידי סינון אולטרה מונעת על ידי הפרש הלחץ. בטווח זה של לחץ פעולה נמוך, חומר מולקולרי קטן יכול לעבור במהירות דרך הממברנה, אך חומרים מקרו-מולקולריים יכולים להילכד על ידי קרום האולטרה-פילטרציה ולהצטבר על פני הממברנה, וכרגע, פני הממברנה והמימיים. לחלץ צורה של הבדל ריכוז כדי לגרום להפרש ריכוז התנגדות קיטוב; עם זאת, עם עליית הלחץ, ההתנגדות לקיטוב הריכוז עולה בהדרגה, והפרש הריכוזים בין משטח הממברנה לתמצית המימית מגיע לשיווי משקל. כאשר הלחץ חורג משיווי משקל זה, ניתן היה לכתוב שכבת ג'ל על פני הממברנה (דבר שתאם את התיאוריה של קיטוב הריכוז ושכבת הג'ל שנוצרה במהלך סינון אולטרה). הלחץ ממשיך לעלות, ועובי שכבת הג'ל גדל, והחלבון שנותר על פני הממברנה גדל, וכתוצאה מכך קצב שמירה נמוך. על מנת להבטיח את אפקט ההפרדה של הממברנה, פרמטר לחץ ההפעלה האופטימלי הוא 0.07MPa.

2.2.2 השפעת הטמפרטורה על קצב שימור החלבון

בתנאי לחץ {{0}}.11MPa, pH 9.0, למד את ההשפעות של טמפרטורות שונות (25 מעלות, 30 מעלות, 35 מעלות, 40 מעלות ו-45 מעלות) על שימור החלבון. התוצאות מוצגות באיור למטה.

 

כפי שמוצג באיור לעיל, עם עליית הטמפרטורה, שיעור ההחזקה של ממברנת האולטרה-פילטרציה עולה בהדרגה, והוא מגיע למקסימום ב-45 מעלות, כאשר שיעור ההחזקה הוא 97.01%. מכיוון שצמיגות הקולגן קשורה קשר הדוק לטמפרטורה: כאשר הטמפרטורה נמוכה יותר, צמיגות הקולגן גדולה יותר, וכך קל לקולגן ליצור עמידות על פני הממברנה, וכתוצאה מכך קצב שמירה נמוך. כאשר הטמפרטורה עולה, צמיגות הקולגן יורדת והאינטראקציה בין מולקולות הקולגן נחלשת, כך שקצב העברת המסה גדל, וקיטוב הריכוזים נחלש, ובכך מגביר את קצב השמירה. סיבה נוספת לעלייה בקצב השמירה היא שהטמפרטורה עולה, ומסיסות הקולגן עולה בהתאם, ותופעת הקולגן החוסם את הממברנה פוחתת. לכן, הטמפרטורה האופטימלית עבור סינון אולטרה היא 45 מעלות.

2.2.3 השפעת ה-pH על שימור חלבון

בתנאי לחץ {{0}}.11MPa וטמפרטורה של 40 מעלות, למד את ההשפעות של תנאי pH שונים, כלומר pH=6.0, pH{ {5}}.{{10}}, pH=8.0, pH=9.0 ו-pH=10.0, על שיעור ההחזקה . התוצאות מוצגות באיור למטה.

 

As shown in the above figure, within the pH value range of 6–7, with the increase of pH value, the protein retention rate decreases, and there is a minimum value of 82.13% at pH=7.0. When pH>7, with the increase of pH value, the retention rate gradually increases. This is because the isoelectric point of collagen pH=7, at the isoelectric point of protein is a precipitation state, easy to stay on the surface of the membrane block membrane, so that the retention rate is low; When pH>7, שיעור השמירה עולה בהדרגה עם עליית ה-pH. הסיבה לכך היא שקרום סינון אולטרה הוא קרום מייפל פוליאתר עם מטען שלילי, קולגן עם מטען שלילי במצב אלקליין, מולקולות קולגן טעונות שלילי וממברנת סינון אולטרה עם אותו מטען יוצרים מצב בלעדי זה מזה, כך שלמולקולות הקולגן לא קל להישאר על פני השטח. של הממברנה, לא קל לחסום את הממברנה, ולכן ה-pH האופטימלי של סינון אולטרה הוא 8-10.

2.3 אופטימיזציה של תהליך סינון אולטרה ואימות תוצאות

ניתוח על ידי Design-Expert8.05 תוכנות מראים שפרמטרי התהליך האופטימליים הם כדלקמן: לחץ הפעלה 0.14MPa, טמפרטורת הפעלה 40.98 מעלות ו-pH של תמיסה=9.43. בתנאים אלה, שיעור השימור היה 92.551%. בהתחשב ביכולת הפעולה של הפרמטרים בפועל, לחץ הפעולה הוא 0.14MPa, טמפרטורת הפעולה היא 40 מעלות וערך ה-pH של נוזל ההזנה הוא 9.50 בתנאי סינון האולטרה. האימות הניסיוני מתחיל לאחר שהמערכת של מכשיר האולטרה סינון מתחילה להיות יציבה. תוצאת שיעור השמירה שהתקבלה היא (92.61 0.1)% (n=3). הערך החזוי של המשוואה דומה בעצם לערך הנמדד, מה שמצביע על כך שתוצאת הפרמטר המותנה החזוי היא בהתאם לתוצאה המותנית בפועל.

2.4 תוצאות ניתוח אלקטרופורזה

הקולגן המטוהר מנותח על ידי אלקטרופורזה SDS-PAGE, והתוצאות מוצגות באיור למטה.

כפי שמוצג באיור שלעיל, מסלול 1 הוא הקולגן המטוהר בניסוי זה ומסלול 2 הוא דגימת הקולגן הסטנדרטית של גיד השוק. ניתן היה לראות מאלקטרופורזה של SDS-PAGE שניתן לזהות את חלבון הקולגן שהוצע בניסוי זה כקולגן, אך הגבולות הלא ברורים לכאורה של שרשרת פפטיד a1 ושרשרת פפטיד a2 אינם ברורים. מהאלקטרופורזה ברור שאין להקות חלבון אחרות, וניתן היה להסיק שטוהר הקולגן המטוהר הוא גבוה.