מחקר על יכולת ניקוי וירוסים של נוגדנים חד-שבטיים במורד הזרם

מוצרים ביוטכנולוגיה שמקורם בשורות תאים עלולים להיות בסיכון לזיהום בנגיף - היקף זה תלוי במספר גורמים, לרבות מקור ההכנה, חומרי הגלם בהם נעשה שימוש, מערכת הייצור, ריאגנטים לטיהור וחומרי עזר. לימוד הסרה או השבתה של וירוסים בתהליך הייצור הוא שלב מרכזי בהפחתת הפוטנציאל להעברה יאטרוגני של וירוסים פתוגניים ובכך להפחית את הסיכון, החיוני לבטיחות המוצרים. לפני שמוצרים ביולוגיים יכולים להיכנס לניסויים קליניים ולשווק, יש להוכיח כי תהליך הייצור שלהם הוא בעל יכולת להסיר וירוסים ידועים ומשוערים.

 

01 הערכת בטיחות של מוצר נוגדנים חד-שבטיים

המחקר על יכולת הסרת הנגיף הוא בדרך כלל על ידי הוספת נגיף האינדיקטור הידוע למוצר הביניים בשלבי ייצור שונים, לאחר מכן קביעת טיטר הנגיף שיורי בדגימה שטופלה בתהליך ספציפי, ולבסוף הערכת ערך הפחתת הלוג (LRV) של טיטר הנגיף. שלבי תהליך עבור LRV גדולים מ-4log10 או שווה ל-4log10 נחשבים בדרך כלל לשלבים יעילים להסרת וירוסים. התהליך עם LRV<41og10 can be considered as helpful to increase the total virus clearance in the production process. However, due to the limitations of virus verification, the process with LRV≤11og10 has little significance for virus removal, and its LRV value is not included in the total amount of the production process.

כאשר משתמשים בשיטה של ​​תהליך ייצור מדומה (תהליך מופחת), יש צורך לתכנן תכנית מחקר ובדיקה סבירה להסרת/השבתת וירוסים הקשורה לתהליך הייצור בפועל ככל שניתן, במיוחד שלבי תהליך הייצור האפקטיביים. התהליך המדומה צריך להיות עקבי בהחלט עם התהליך בפועל מבחינת פרמטרי הבדיקה ותנאי הבקרה.

 

02 מציין בדרך כלל וירוסים ותכניות אימות

וירוסי אינדיקטור נפוצים מוצגים בטבלה 1.

בשלב הניסוי של יישום חדש לתרופה (IND), מוצר ביוטק דורש מחקרי פינוי ויראלי של לפחות 2 דגמי נגיפים, בדרך כלל בחירה רטרו-וירוס אחד (X-MuLV) ו-parvovirus אחד (MMV). במהלך שלב הבקשה לרישיון ביולוגי (BLA), מחקרי הסרת וירוסים נערכים בדרך כלל באמצעות 3-5 וירוסים ספציפיים/לא ספציפיים ו-3-5 שלבי תהליך מוערכים כדי להוכיח שלמוצר יש מקדם בטיחות מתאים מ- פרספקטיבה של בטיחות וירוסים. עקב הנחיות שונות בבית ומחוצה לה, ישנם כמה הבדלים בשלבי אימות ניקוי הנגיף המשמשים להצהרות. סכימות אימות פינוי הנגיפים הנפוצות בתהליך ייצור mAb מוצגות בטבלה 2.

 

03 יכולת הסרת וירוסים של תהליכים במורד הזרם

3.1 היכולת של תהליכים במורד הזרם להסיר וירוסים שונים

החל משנת 2009, מוצרי נוגדנים חד שבטיים הוגשו ל-FDA עבור IND ו-BLA, כרומטוגרפיית זיקה של חלבון A, pH נמוך, כרומטוגרפיה של חילופי אניונים AEX (מצב חדירת זרימה), כרומטוגרפיה חילופי קטונים CEX (קישור - מצב elution), ואימות פינוי וירוסים לא כולל סינון וירוסים הם משפחות האינדיקטורים הנפוצות ביותר של וירוסים והממוצע והטווח של השפעות הפינוי שלהם מוצגים ב איור 1.

עבור רטרו-וירוסים, למעט CEX, שיש לו LRV של כ-3log10 (כפי שמוצג בתרשים A-bar באיור 1), שאר התהליכים היו חזקים (LRV גדול מ-4log10 או שווה לו). להרפס וירוסים ולרטרו-וירוסים יש השפעות פינוי דומות ו-LRV > 4log10 (כפי שמוצג בתרשים B-bar באיור 1). וירוסים קטנים לא עטופים, כגון parvovirus, קשים יותר להסרה יעילה, עמידים לטיפול כימי ואינם נלכדים בקלות על ידי מסננים (מוצג בתרשים C-bar באיור 1). רק מסנני AEX ומסנני וירוסים קטנים היו יעילים בהסרת parvoviridae (ממוצע LRV > 4log10).

התהליכים המוצגים באיור 1 הם ProteinA, AEX (מצב חדירת זרימה), CEX (מצב דליפה-צירוף), אי הפעלה של pH נמוך ("לא שלם "מול" "הסרה" מלאה), וסינון דווירוס עם צמצם גדול וקטן.

 

3.2 גורמי השפעה של תהליכים במורד הזרם על יכולת הסרת וירוסים

ההתפלגות של ערכי LRV עבור כל תהליך מוצגת באיור 2. המחקרים עם 0 ~ 21og10 סווגו כקבוצת LRV נמוכה, ואלו עם יותר מ-6log10 סווגו כקבוצת LRV גבוהה לצורך ניתוח השוואתי.

 

3.2.1 כרומטוגרפיית זיקה של ProteinA

לא היה מתאם מובהק בין ערך ה-LRV של תהליך חלבון A לבין חיץ האיזון/השטיפה, חומר המילוי, הרכב חומר הפלטה וערך ה-pH של החלוקה. המכנה המשותף של קבוצת ה-LRV הנמוכה הוא שחומר ההזנה מורכב למדי, וייתכן שהאינטראקציה המורכבת של חומרי הזנה וחומרי המילוי משפיעה לרעה על היכולת של העמודה הכרומטוגרפית להסיר וירוסים.

 

3.2.2 AEX (מצב זרימה)

שטראוס וחב'. הראה שה-pH והמוליכות של דגימות AEX יכולים להשפיע על ה-LRV. עם זאת, התוצאות הסטטיסטיות של Miesegaes וחב' הראו שבדומה ל-ProteineA, ל-LRV של AEX (מצב חדירת זרימה) לא היה מתאם מובהק עם חוצצים, חומרי מילוי, pH ומוליכות שונים, מה שעשוי לנבוע מאופטימיזציה של pH ומוליכות. בתנאי תהליך המקרה המדווח.

 

3.2.3 CEX(Binding - Elution Mode)

הסרת וירוסים על ידי תהליך CEX אינה חזקה מספיק. לא היה מתאם מובהק בין ה-LRV בקבוצת ה-LRV הגבוה לבין המאגר, רמת הניסיון או כל מאפייני העמודה הכרומטוגרפית, כגון גובה העמודה וסוג השרף. עם זאת, ערכי ה-PH של שיווי המשקל/טעינה והפליטה ששימשו במחקר ה-LRV הגבוה היו שניהם נמוכים יותר, ב-5.3±0.2; בקבוצת ה-LRV הנמוכה, ה-pH היה 6.0±0.2. גורם נוסף הוא שריכוז המלח במאגר יכול לגרום גם להבדל ערכי ה-LRV. למאגר ששימש במחקר ה-LRV הנמוך היה ריכוז מלח גבוה יותר, עם ריכוז ממוצע של 290±120 מ"מ בתמיסת הטעינה/איזון ו-340±70 מ"מ במפלט, בעוד שריכוזי NaCl במחקר ה-LRV הגבוה היו 58 ±27 מ"מ ו-183±31 מ"מ בהתאמה.

 

3.2.4 נטרול pH נמוך

בתהליך pH נמוך, pH הוא פרמטר מפתח בתהליך, ו-pH של 3.8 מספיק כדי להשבית את הרטרו-וירוס בדרגה. לקבוצת ה-LRV הנמוכה היה pH של 3.9, בעוד שבמחקר ה-LRV הגבוה היה pH של 3.4.

 

3.2.5 הסרת סינון וירוסים

עבור מסנני צמצם קטנים וגדולים כאחד, ערך ה-LRV של הסרת MuLV היה לא פחות מ-2log10, ורק 1% מהמחקרים היו מתחת ל-3log10 (מוצג בעמודות h ו-i באיור 2). הפינוי הכולל של רטרו-וירוסים על ידי מסנני וירוסים עם צמצם גדול היה נמוך יותר מזה של מסנני וירוסים עם צמצם קטן (כפי שמוצג בתרשים C-bar באיור 1). הסיבה העיקרית המשפיעה על התוצאה של הסרת parvovirus היא סוגי המסננים השונים. באופן כללי, סינון אנטי וירוס יכול להסיר וירוסים בצורה מהימנה.

התהליכים הם חלבון A(a), מצב חדירת AEX (ב), קשירת CEX - מצב elution (c), AEX binding Ⅰ מצב elution (d), אי-אקטיבציה של pH נמוך ("לא שלם "ו" "ניקוי מלא)(e ~ g), וגודל נקבוביות גדולות (h) וגודל נקבוביות קטנות (i ~ j) סינון דווירוס (כאשר, a ~ i: רטרו-וירוס; j: Parvovirus).

 

04 חידושים ואתגרים בהערכת אבטחת וירוסים

הפיתוח והחדשנות המתמשכים בתחום התהליכים הביו-פרמצבטיים במורד הזרם יביאו בהכרח לחידושים בהערכת פינוי וירוסים. ההתקדמות בתהליכים במעלה הזרם והמורד הזרם - כגון תהליכי ביו-זרם מתמשכים - גרמה להעריך ולבסס תהליכי הסרת וירוסים יעילים וחזקים. במהלך זרימה מתמשכת, עדיין צפויים להתבצע שלבים כגון ביטול וירוסים וסינון וירוסים במצב אצווה. למרות שיכולת הסרת הווירוס של תהליכים כרומטוגרפיים במצב זרימה רציפה לא צריכה להיות שונה מהותית מזו של עיבוד אצווה, היא חייבת להיתמך בנתונים.

 

05 אאוטלוק

מנקודת מבט של בטיחות וירולוגית, הבטיחות המצוינת של תעשיית הביו-פרמצבטיקה יכולה להיות מיוחסת במידה רבה להקפדה של התעשייה על שלוש אסטרטגיות מפתח לבטיחות ויראלית: מקורות ובדיקה נאותים של חומרים ומקורות בנק תאים, תיעוד הערכות פינוי ויראלי (מחקרי אימות וירוסים), וכן בדיקות ויראליות בתהליך. המאפיינים של תרופות ביולוגיות המיוצרות על ידי מצעי תאים חדשים עשויים להשתנות עם סיכונים שונים, ונדרשות אסטרטגיות ניהול סיכונים טובות כדי להבטיח את בטיחותן של תרופות ביולוגיות. ל-Guidling Technology יש צוות טכני מקצועי מנוסה, המכסה את תהליך הסינון מניסוי קטן, ניסוי פיילוט, לייצור בקנה מידה גדול, מסנני הממברנה והממברנה שלנו נמצאים בשימוש נרחב בסינון מקדים, מיקרו סינון, אולטרה סינון, ריכוז ננופילטרציה, מיצוי והפרדה; קווי המוצרים הרבים שלנו, החל מסינון מעבדה חד-פעמי קטן ועד למערכות סינון מוכוונות ייצור, בדיקות סטריליות, תסיסה, תרבית תאים ועוד, מבטיחים פרודוקטיביות מוגברת.

Jiuling כדי להבטיח את איכות המוצר כאינדיקטור הראשון, במרדף אחר "הפחתת עלויות, הגדלת יעילות" בדרך לחקור, מצפה לעבוד איתך בעתיד כדי להתמודד עם אתגרי התעשייה ולחפש פיתוח טוב יותר.