מחקר על יישום סינון עמוק בתהליך הייצור של חיסון למחלת הפה והטלפיים

הקדמה - מהי מחלת הפה והטלפיים

במאה ה-14, ישנם תיעוד כתוב על מחלת הפה והטלפיים דומות באירופה. מחלת הפה והטלפיים היא מחלה חריפה, קדחתנית, מדבקת מאוד הנגרמת על ידי נגיף מחלת הפה והטלפיים.

התסמינים הקליניים של בעלי חיים בוגרים כוללים: עלייה בטמפרטורת הגוף, שלפוחית ​​וכיב בפה, שלפוחית ​​וכיב בפרסה, ואף נשירת קליפת פרסה, הגורמת לקושי באכילה ושינה, ירידה במשקל ואף אובדן ערך כלכלי בבעלי חיים כלכליים. ;

התסמינים הקליניים של בעלי חיים צעירים כוללים: עלייה בטמפרטורת גוף, דלקת שריר הלב ותסמינים נוספים, לאחר הופעתן, לבעלי חיים צעירים יש תמותה גבוהה.

 

תַקצִיר

במהלך 500 השנים האחרונות, מחלת הפה והטלפיים התפרצה שוב ושוב ברחבי העולם, ומספר רב של חזירים, בקר, כבשים וחיות בית אחרות ובעלי פרות בר עם אצבעות רגליים מתו או חלו, ופגעו קשות במשק החי. ותעשיית הגידול.

 

על מנת לחקור את היישום של טכנולוגיית סינון עמוק בתהליך הייצור של חיסון נגד מחלת הפה והטלפיים, נבדקו והשוו ביצועי הסינון של סינון פני השטח והסינון העמוק, כמו גם ההשפעה המגנה על סינון קוטל חיידקים. נלמדו היתרונות של סינון עמוק במטען גבוה בהסרת פסולת תאים. נותחו תוכניות הסינון המקבילות עבור מדיום תרבית תאים עם עכירות שונה.

 

התוצאות הראו שעומס הסינון העמוק היה פי 13.9 מזה של סינון פני השטח, העכירות של נוזל המסנן הייתה רק 23.5% מסינון פני השטח, ועומס הדבקטריאליזציה של 0.2um שלאחר מכן היה פי 7.2 מזה של סינון פני השטח. על ידי שימוש בליגנד השרף המיוחד שלו, העכירות של נוזל המסנן היא 38.6% מזו של המסנן העמוק הרגיל עם אותו גודל נקבוביות, מה שמועיל להגנה על התהליך במורד הזרם. התוצאות הראו שניתן ליישם ביעילות סינון עמוק, במיוחד סינון עמוק מטען חיובי חזק, לייצור חיסון נגד FMD, ויש להקים תהליכי סינון מתאימים עבור מדיות תרבות שונות.

 

מחלת הפה והטלפיים וסינון עמוק

מחלת הפה והטלפיים (FMD) היא מחלה חריפה, קדחתנית ומדבקת של בעלי חיים שסועים הנגרמת על ידי נגיף מחלת הפה והטלפיים (FMDV). בעלי החיים הרגישים ביותר למחלה זו כוללים בקר, חזירים וצאן. מחלת הפה והטלפיים אנדמית באסיה, אפריקה, המזרח התיכון ודרום אמריקה, עם שכיחות גבוהה מאוד והעברה מהירה. הארגון העולמי לבריאות בעלי חיים (OIE) מציין אותה כמחלה זואונוטית בקטגוריה A הראשונה, המחייבת את המדינות החברות לכלול את מחלת הפה והטלפיים ברשימת מחלות בעלי חיים הניתנות לדיווח. חיסון הוא אמצעי יעיל למניעה ספציפית של FMD. חיסון מומת ל-FMD, המיוצר על ידי השבתת נגיף שלם עם אינאקטיבטור, ממלא תפקיד חשוב במניעה ובקרה של FMD.

האנטיגניות של FMDV עצמו ירודה, ולנטרול הנגיף יש השפעה רבה על האנטיגן שלו. לכן, בייצור הנוכחי של חיסון ל-FMD, חיסון ל-FMD בטוהר גבוה יכול להבטיח את תכולת האנטיגן וטוהר המנה היחידה, שהיא חשובה במיוחד והיא גם אסטרטגיית החיסון הנוכחית. זה מציב דרישות גבוהות לטיהור במורד הזרם של וירוסים. בנוסף, לפני 2009, במעלה הזרם של חיסוני מחלת הפה והטלפיים המומתים בסין אימצו בעיקר את שיטת התרבות של סיבוב בקבוק והיצמדות לקיר. עם הביקוש הגובר לחיסונים, הופיעו בהדרגה החסרונות של שיטת תרבית זו הדורשת מספר רב של בקבוקים מסתובבים, יעילות נמוכה ורמת ביטוי נמוכה.

לכן, בשנים האחרונות, טכנולוגיית תרבית התאים השתנתה לאט מהתרבית הדביקה הקודמת לתרבית תרחיף, וייצור הנגיף שופר משמעותית. עם זאת, עם העלייה בייצור הנגיף, שינוי אופן התרבית הביא לחץ גדול יותר לטיהור במורד הזרם, מכיוון שפסולת התא שנוצרה בתהליך התרבות, שחרור התא של חלבוני המארח, ה-DNA המארח וכו', גדלה בהתאם, מה מציב דרישות נוספות ליכולת הטיהור במורד הזרם.

טכנולוגיית סינון ממברנה נמצאת בשימוש נרחב בתהליך הייצור של מוצרים ביולוגיים כגון חיסונים, ביניהם טכנולוגיית סינון DC משמשת בדרך כלל בתהליך הקציר של ארס מחלות להפרדת זיהומים בלתי מסיסים כגון פסולת תאים. בבירור ה-FMDV המוקדם, אומצה בעיקר טכנולוגיית סינון פני השטח המיוצגת על ידי אלמנט מסנן הממברנה המתקפלת. עם השינוי בתנאי התרבית, עלייה בזיהומים של פסולת תאים, קשה לסינון פני השטח להשיג את אפקט ההבהרה, ומכיוון שעומס סינון פני השטח נמוך, עלות חומרי הסינון הולכת וגוברת.

 

תחת הרקע לעיל, סינון עמוק יושם יותר ויותר בתהליך של הפרדת ציטונוזלים של FMDV. חומר הסינון העמוק מורכב בדרך כלל מסיבים ארוכים ועדינים ממקורות טבעיים, והתעלה שנוצרת על ידי מדיום הסינון לאחר יצירת סרט היא לרוב מפותלת מאוד, בדומה למבנה פתח המבוך. חלקיקי טומאה נלכדים לעתים קרובות בתוך המסנן ולא על פני השטח. יתר על כן, דופן תעלת המסנן סופגת לעתים קרובות חלק מזיהומי חלקיקים עדינים במיוחד על ידי פעולה אלקטרוסטטית או כוח בין-מולקולרי. באופן כללי, מנגנון הסינון של סינון עמוק מאופיין בשמירה וספיחה מכנית.

 

שיטת סינון זרם קבוע

התקן את צלחת המסנן העמוק למכשיר המסנן הזרם הקבוע, שטפו את צלחת המסנן עם חיץ PBS מעל 54 L/m2; לאחר סיום הכביסה, הפעל את המשאבה הפריסטלטית כדי לשאוב לאט את הנוזל, התאם לאט את מהירות המשאבה בערך לקצב הזרימה הצפוי, וסנן את הנוזל. רשום את נפח הסינון, הזמן, הפרש הלחצים והעכירות במהלך תהליך הסינון. התסנין נאסף לזיהוי אנטיגן.

 

יתרונות סינון עמוק

סינון פני השטח הוא טכנולוגיה הלוכדת חלקיקים על פני חומר המסנן כדי להשיג סינון. מנגנון הסינון מבוסס בעיקר על גודל החלקיקים במסננת הנוזלים, חלקיקים גדולים נלכדים על פני קרום המסנן. סינון עמוק מנצל תעלות פנימיות ליירוט חלקיקים וספיחה בעומק. תרשים ההשוואה של השניים מוצג באיור 1.

התמיסה המושבתת של חיסון למחלת הפה והטלפיים מיצרן מסוים עבר סינון מראש על ידי ממברנת משטח פוליפרופילן 0.45um וצלחת סינון עמוקה בהתאמה, ולאחר מכן סוננה על ידי מסנן חיידקי 0.2um. נתוני יכולת הסינון מוצגים בטבלה 1.

 

עכירות התמיסה המומתת של חיסון מחלת הפה והטלפיים היא 77 NTU. אם החיידק מסונן ישירות, מספר רב של שברי תאים יגרום בהכרח לחסימת ממברנת הסינון 0.2um במהירות, מה שישפיע על העברת חלקיקי 146S. לכן תוכנן סינון מקדים לפני סינון דה-בקטריאליזציה, והושוו שתי שיטות הקדם-סינון של סינון עמוק וסינון פני השטח. פלטת הסינון העמוקה שכבה כפולה נבחרת לסינון, העומס הוא 641 L/m2, והפילטר העמוק מפחית את החומר של 77 NTU ל- 9.65 NTU, שהוא שקוף ובהיר. עומס סינון פני השטח של 0.45um הוא רק 46 ליטר/מ"ר, והעכירות של נוזל המסנן גבוהה עד 41 NTU, דבר שאינו מתאים לסינון מקדים. על פי ההשוואה של עומס הסינון הדה-בקטריאלי של 0.2um שלאחר מכן, עומס קרום הסינון הדה-בקטריאלי לאחר סינון עמוק הוא 655 ליטר/מ"ר, שהם פי 7.2 מעומס סינון סינון פני השטח המקביל (91 ליטר/מ"ר בלבד) .

תוצאות בדיקת 146S מראות כי התפוקה של מערכת סינון עמוק גבוהה מזו של מערכת סינון פני השטח. עומס הסינון העמוק היה פי 13.9 מזה של סינון פני השטח, העכירות של נוזל המסנן הייתה רק 23.5% מזו של סינון פני השטח, ועומס הסינון שלאחר מכן 0.2um מסיר חיידקים היה פי 7.2 מזה של סינון פני השטח. לכן, הן מבחינת העלות והן מבחינת התפוקה, מערכת הסינון העמוק טובה משמעותית ממערכת סינון הממברנות העיליות.

 

היתרונות של מסנן עמוק מטען חיובי חזק

צלחת הסינון העמוקה מטען חיובי וצלחת הסינון העמוקה מטען חיובי חזק שימשו להשוואת הפתרון המומת של חיסון למחלת הפה והטלפיים ממקורות שונים. תוצאות יכולת הסינון מוצגות בטבלה 2, ושינוי מהירות הסינון והפרש הלחץ בתהליך הסינון מוצג בפריסת הצבע 2.

לשתי הקבוצות של לוחות סינון עמוקים בשימוש יש דיוק צמצם זהה, והביצועים עקביים מאוד מנקודת המבט של שינוי עומס והפרשי לחץ, ועקומת שינוי הפרשי הלחץ באיור 2 זהה בעצם.

 

עם זאת, מהעכירות של נוזל המסנן, ההבדל גדול מאוד. נוזל הסינון של פלטת הסינון הכפולה בעלת הטעינה חיובית הרגילה הוא 25 NTU, בעוד שנוזל הסינון של לוח הסינון השכבה העמוקה הטעון חזק עם אותו פתח הוא רק 9.65 NTU, שהם רק 38.6% מלוח הסינון העמוק הרגיל. זה נובע בעיקר מהליגנד השרף המיוחד בחומר מסנן צלחת המסנן העמוקה במטען חיובי חזק. העכירות מופחתת לפחות מ- 10NTU על ידי לוחית הסינון הדו-שכבתית החיובית החזקה, ושברי התאים נספגים במלואם או נלכדים, מה שמסייע לתהליך האולטרה-סינון או סינון החיידקים הבאים. בנוסף להשפעת הספיחה על פסולת תאים בלתי מסיסים, Yigzaw Y וחב' דיווחו גם על השפעת ההסרה של לוח מסנן עמוק טעון חיובי חזק על חלבון מארח התא, ו- Dorsey N וחב' דיווחו על השפעת ההסרה של צלחת סינון עמוקה בעלת מטען חיובי חזק. על DNA.

 

הקמת תהליך סינון בירור לסופרנטנט של חיסון מחלת הפה והטלפיים על ידי סינון עמוק

באמצעות המחקר ההשוואתי לעיל של סינון פני השטח וסינון עמוק, וחקר השפעת ההבהרה של לוח הסינון העמוק המטען החיובי החזק המיוחד, יש להתאים סכימות סינון שונות לסופרנטנט המושבת של חיסון למחלת הפה והטלפיים המיוצר תחת שונות תנאי תרבות. עבור סופרנטנט צנטריפוגלי עם 3 עכירות שונות, עכירות נמוכה, עכירות בינונית ועכירות גבוהה, ערכת הסינון העמוק ופרמטרי הסינון המתאימים מוצגים בטבלה 3.

עבור הסופרנטנט הצנטריפוגלי עם עכירות נמוכה, לוח הסינון העמוק בשכבה אחת יכולה להבהיר ולהסיר ביעילות כמות קטנה של פסולת תאים. עבור הסופרנטנט הצנטריפוגלי בעל עכירות בינונית, צלחת המסנן העמוק השכבה הכפולה יכולה להבהיר ביעילות, במיוחד לוח המסנן העמוק של המטען החיובי יכול להפחית את העכירות לפחות מ-5 NTU; עבור סופרנטנט צנטריפוגלי עם עכירות גבוהה יותר, ניתן להבהיר ביעילות את לוח הסינון המשולב. לא משנה באיזה תהליך, קיבולת העיבוד היא 500 ~ 800 ליטר/מ"ר, העכירות של נוזל המסנן היא פחות מ-20 NTU, והאנטיגן היעד מוחזר במלואו, מתאים לייצור בקנה מידה גדול.

 

דִיוּן

בשנות ה-70 נקבע כי אמצעי הסינון לא ישתמשו בחומרי אסבסט, בגלל נוכחותם של חומרים מסרטנים בחומרי אסבסט. חומר המסנן העמוק אינו מכיל אסבסט ובעל מטען חיובי חזק יותר. חומר הסינון עשוי מטריצת סיבי עץ ועזר לסינון. בתהליך הייצור משתמשים בשרף פולימרי לחיבור המרכיבים הבסיסיים, והקבוצות הפונקציונליות של המטען החיובי שבו מעניקות למעשה יכולת ספיחת המטען של חומר המסנן העמוק. הביצועים המצוינים של סינון עמוק ספיח על יכולת הלכידה של חלקיקים עדינים מוצגים באיור 3.

בניסוי זה, נבחרו רכיבי שרף שונים וחומרי סינון עמוקים מדויקים שונים כדי להבהיר את בדיקת הסינון של תמיסת תרבית FMDV, ובדיקת ההשוואה בוצעה עם סינון פני השטח. התוצאות הראו שסינון עמוק מתאים יותר להסרת פסולת תאים מאשר סינון פני השטח, דבר שהועיל ליחידת סינון בקרת העומס המיקרוביאלי שלאחר מכן (0.2um). בנוסף, על ידי השוואת השפעת הסינון של לוח המסנן העמוק במטען חיובי חזק ולוח המסנן העמוק במטען חיובי רגיל, לוח המסנן בעל המטען החיובי החזק מראה יכולת בקרת עכירות חזקה, שיכולה להפחית את העכירות לפחות מ-5 NTU, אשר תורם מאוד לשיפור החוסן של תהליך הסינון כולו.

לתהליך התרבות במעלה הזרם יש השפעה רבה על שלבי הקציר של החומרים הפעילים. באמצעות בדיקה, ניסוי זה הקים לבסוף ערכת סינון ניתנת להרחבה עבור מדיית תרבית תאים עם עכירות שונה, שיש לה משמעות מנחה מסוימת לייצור בקנה מידה גדול.

מסנן העומק שיושק על ידי Guidling Technology הוא אלמנט מסנן מסוג דיסק, שהוא מעין אלמנט סינון יעיל עם קרטון סינון עמוק כחומר המסנן, העומד במלוא הדרישות הרגולטוריות של ביו-פרמצבטיקה, שתוכנן ומיוצר במיוחד להסרה של תוכן מוצק גדול כגון תאים ושברי תאים, וניתן ליישם על נוזל תרבית תאים של יונקים; בירור ליזאט של חיידקים ותאי שמרים; הסרת חלבון התא המארח (HCP); הסר וירוס ו-DN; הסרת אנדוטוקסינים; הסרת מסיר קצף.

למוצר יש יתרונות של נפח מת קטן, הגברה ליניארית, מבנה קפסולת דיסק, עיצוב מבנה קומפקטי, וניתן להשתמש בו בסדרה עם ציוד אחר, טביעת רגל קטנה, קצב זרימה יציב, חיים ארוכים ועלות נמוכה.