עקרונות בסיסיים וזרימת עבודה של -Phase Peptide Synthesis (SPPS)

סינתזת פפטידים מוצק-(SPPS)היא שיטה לסינתזה של פפטידים על תומך מוצק. האסטרטגיות העיקריות של SPPS כוללות אתשיטת בוקואתשיטת Fmoc. סינתזת פפטידים היא תהליך חוזר ונשנה של הוספת חומצות אמינו ברצף ומתבצע בדרך כלל מה-C-terminus (קצה קרבוקסיל)אל הN-סוף (קצה אמינו). ראשית, קבוצת הקרבוקסיל של חומצת האמינו הראשונה של פפטיד המטרה מחוברת באופן קוולנטי לתמיכת מוצקה (שרף). תוך שימוש בקבוצת האמינו של חומצת אמינו זו כנקודת ההתחלה, מסירים את קבוצת ההגנה הקצה N-, ושרשרת הפפטידים הגדלה מתארכת על ידי תגובה עם עודף של חומצת אמינו שנייה מופעלת. מחזור זה-צימוד ← כביסה ← ביטול הגנה ← נטרול ושטיפה ← הצימוד הבא-חוזר על עצמו עד להשגת אורך הפפטיד הרצוי. לבסוף, שרשרת הפפטיד מבוקעת מהשרף ומטוהרת להשגת פפטיד המטרה. כאשר קבוצת האמינו -מוגנת עםBoc (tert-butyloxycarbonyl), מכונה השיטהסינתזת פפטיד מוצק-מבוססת-Boc. כאשר קבוצת האמינו -מוגנת עםFmoc (9-fluorenylmethyloxycarbonyl), זה ידוע בשםסינתזת פפטיד מוצק-על בסיס-Fmoc.

 

סינתזת פפטיד שלב-מבוססת-Boc (שיטת Boc)

ב-שיטת בוק, קבוצות בוק ניתנות להסרה על ידי חומצה טריפלואוראצטית (TFA)משמשים להגנה על -קבוצות האמינו, בעודקבוצות הגנה מסוג בנזיל-מועסקים עבור שרשראות צד. במהלך הסינתזה, חומצת אמינו-מוגנת - של Boc מקושרת לראשונה באופן קוולנטי לשרף. לאחר מכן מסירים את קבוצת ה-Boc עם TFA, וסוף האמינו החופשי המתקבל מנוטרל עם טריאתילאמין. חומצת האמינו הבאה מופעלת באמצעותDCC (dicyclohexylcarbodiimide)ומצמד להארכת שרשרת הפפטידים. לאחר השלמת ההרכבה, פפטיד המטרה מבוקע מהשרף באמצעות חומצה חזקה, בדרך כללמימן פלואוריד נטול מים (HF)אוֹחומצה טריפלואורומתאן-סולפונית (TFMSA)בשיטת סינתזה של Boc, נדרשים טיפולי חומצה חוזרים על מנת להסיר קבוצות הגנה לפני כל שלב צימוד. זה יכול להוביל למספר תגובות לוואי, כגון ביקוע מוקדם של הפפטיד מהשרף וחוסר יציבות של שרשראות צד של חומצות אמינו בתנאים חומציים, וכתוצאה מכך תגובות לוואי לא רצויות.

 

Fmoc-מבוסס סינתזת פפטידים מוצק-(שיטת Fmoc)

ב1978, מיינהופר ואתרטוןפיתח אסטרטגיית סינתזת פפטידים באמצעותFmoc (9-fluorenylmethyloxycarbonyl)בתור -קבוצת ההגנה על אמינו, הידועה בשםשיטת Fmoc. בגישה זו, קבוצת האמינו -מוגנת באמצעותbase-labile Fmoc, בעוד שרשראות הצד מוגנות עםחומצה-לאבילית מסוג Boc-קבוצות הגנהיתרון מרכזי של Fmoc כקבוצת הגנה אמינית- הוא שלויציבות בתנאים חומציים; זה לא מושפע מטיפול עם ריאגנטים כגוןחומצה טריפלואורית (TFA)וניתן להסירו באופן סלקטיבי באמצעותבסיס עדין. יחד עם זאת, קבוצות הגנה על שרשרת צד- כגון Boc יציבות בתנאים בסיסיים ומוסרות בטיפול חומצי. לבסוף, הפפטיד מבוקע כמותית מהשרף באמצעותTFA/דיכלורומתאן (DCM), הימנעות משימוש בחומצות חזקות ובכך משפרות את הבטיחות והתאימות לסינתזת פפטידים שגרתית.

 

היסטוריית התפתחות של -Phase Peptide Synthesis (SPPS)

1. שלב היסוד (תחילת המאה ה-20 עד 1963)

ב1902, אמיל פישרהיה הראשון שחקר סינתזת פפטידים, אך ההתקדמות הייתה איטית עקב מגבלות טכניות. שימוש בסינתזות מוקדמותקבוצות הגנה של בנזואיל ואצטיל, שהיו קשים להסרה ולעתים קרובות הובילו אליהםביקוע שרשרת פפטידים.

ב1932, מקס ברגמןועמיתים לעבודה-הציגו אתקבוצת בנזילוקסיקרבוניל (Z).בתור -קבוצת אמינו המגנה. ניתן להסיר את הקבוצה הזו תחתהידרוגנציה קטליטית או תנאים חומציים, מספק כלי אמין יותר לסינתזת פפטידים ומניח את הבסיס לפיתוח של סינתזת פפטידים מוצק-בשנות ה-60.

במהלך ה1950s, מדענים סינתזה בהצלחה מגוון שלפפטידים פעילים ביולוגית, כגוןאוקסיטוצין ואינסולין. הישגים אלה קידמו עוד יותר את הכימיה של הפפטידים וביססו את הבסיס להופעתה של סינתזת פפטידים מוצק-.

 

2. הבמה החלוצית (1963)

ב1963, רוברט ב. מריפילדהציע אתשיטת סינתזת פפטידים מוצק-(SPPS)., שבו החומצת אמינו סופנית C-מעוגן לתמיכת שרף, ושרשרת הפפטידים מתארכת באמצעות מחזורים חוזרים שלהסרת הגנה וצימוד. גישה זו פשטה מאוד את תהליך סינתזת הפפטידים והפכה ל-שיטה מועדפתלהרכבת פפטידים.

מריפילד בשימושBoc (tert-butyloxycarbonyl)כדי להגן על -קבוצת האמינו. בסוף שנות ה-60, הוא גם פיתח אתסינתיסייזר פפטידים אוטומטי לחלוטיןוסונתז בהצלחהחלבונים ביולוגייםכְּגוֹןריבונוקלאז (124 חומצות אמינו). על הישגים פורצי דרך אלה, זכה Merrifield בפרספרס נובל בכימיה לשנת 1984.

 

3. שלב החדשנות הטכנולוגית (1972)

ב1972, לו קרפינופיתח אתקבוצת הגנה 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc)., מה שיכול להיותהוסר בעדינות בתנאים בסיסיים, הפחתת תגובות לוואי. זה הפך אותו למתאים במיוחד עבורפפטידים מורכביםוסינתזה אוטומטית.

השיטת Fmocהחליף בהדרגה את שיטת בוק כאסטרטגיית הזרם המרכזי. סינתיסייזרים פפטידים אוטומטיים המבוססים על שניהםFmoc ו-Boc כימיהפותחו לאחר מכן, והניעו אתאוטומציה של סינתזת פפטידיםומשפרת מאוד את היעילות והשחזור.

 

4. שלב בגרות והתרחבות (שנות התשעים עד היום)

אופטימיזציה של שרף וריאגנטים:פיתוח שלשרפים עם-טעינה גבוהה, הידרופיליים ב-PEG-וריאגנטים צימודים יעילים כגוןHBTUוHATUשיפרה משמעותית את היעילות והתשואה של סינתזת פפטיד מוצק-(SPPS).

אינטגרציה טכנולוגית:גישות חדשות כמוסינתזה בסיוע-מיקרוגלוכימיה של זרימהקיצור זמני תגובה והגדלת התשואות עוד יותר.

 

עקרונות בסיסיים וזרימת עבודה של SPPS:
עקרון הליבה של סינתזת פפטידים מוצק-הוא הבנייה בדרגה של שרשרת פפטיד על תומך מוצק, באמצעותהגנה על אסטרטגיות קבוצתיותותגובות עיבוי (צימוד).להשיגמכלול פפטידים יעיל וניתן לשליטה.

1. תפקידו של התמיכה המוצקה (שרף) בסינתזת פפטיד מוצק-(SPPS)

A שרף פולימרי בלתי מסיס-כגוןפוליסטירן-דיווינילבנזן שרף-צולב, שרף וואנג או שרף אמיד רינק-נבחר כתמיכה המוצקה ב-SPPS. משטח השרף מכילקבוצות פונקציונליות(למשל, קבוצות הידרוקסיל או אמינו) שיכולות להיווצרקשרים קוולנטיים עם קצה אחד של שרשרת הפפטידים, בדרך כלל הג-מסוף, עיגון הפפטיד לתומך המוצק. חיבור קוולנטי זה מבטיח שהפפטיד הגדלנשאר קשור לשרף לאורך כל הסינתזה, אשר מאודמקל על שלבי התגובה הבאים, שטיפה וטיהור

 

2. הגנה על אסטרטגיית הקבוצה בסינתזת פפטיד מוצקה-(SPPS)

במהלך סינתזת פפטידים, ה-קבוצת אמינו, קבוצת קרבוקסיל וקבוצות פונקציונליות צדדיות-תגובתיותשל חומצות אמינו (כגון תיול, קרבוקסיל וקבוצות אמינו) מועדות לתגובות לוואי. כדי למנוע את התגובות הלא רצויות הללו,קבוצות הגנהנמצאים בשימוש. קבוצות הגנה נפוצות כוללות:-קבוצות הגנה על אמינו:

Boc (tert-butyloxycarbonyl):חומצה-לא חוקית, מוסרת בקלות מתחתתנאים חומציים.

Fmoc (9-fluorenylmethyloxycarbonyl):יציב בתנאים חומציים, ניתן להסיר מתחתתנאים בסיסיים(למשל, תמיסת piperidine/DMF).קבוצות צד-הגנת שרשרת:נבחר על פי המאפיינים הכימיים של השרשרת הצדדית של חומצות האמינו. הקבוצות השכיחות כוללותבנזיל (Bn), tert-butyl (tBu), trityl (Trt)וכו' קבוצות אלו הןהוסר בסוף הסינתזה, בדרך כלל במהלך מחשוף פפטיד מהשרף, באמצעותחומצה או תנאים ספציפיים אחרים.

 

3.C-Terminus to N-Terminus Synthesis ב-SPPS

בסינתזת פפטידים מוצק-(SPPS), הרכבת פפטידים מתחילה בדרך כלל ב-C-terminus (קצה קרבוקסיל)ומתקדם בהדרגה לעבר הN-סוף (קצה אמינו). זה בגלל שחומצת אמינו C- סופנית מחוברת תחילה לתמיכה המוצקה, וחומצות אמינו עוקבות מחוברות ל-קבוצת אמינו חופשית של שרשרת הפפטידים שכבר קשורה לשרף, מאריך בהדרגה את שרשרת הפפטידים.

 

4. תגובת צימוד בסינתזת פפטיד מוצק-(SPPS)

חומצות אמינו מוגנות צריכות להיותמוּפעָלכך שלהםקבוצות קרבוקסיל הופכות לתגובתיות, המאפשר להם ליצור אקשר פפטידעם קבוצת האמינו של הפפטיד הקשור לשרף-. מְשׁוּתָףריאגנטים מפעיליםלִכלוֹלקרבודיאימידים(למשל, DCC, DIC),HOBt, HATU, וPyBOP. לאחר ההפעלה, קבוצת הקרבוקסיל מגיבה עם קבוצת האמינו החופשית ב-aתגובת עיבוי, יוצרקשר אמידובכך מחברים את חומצת האמינו החדשה לשרשרת הפפטידים ההולכת וגדלה.

 

5. פעולות חוזרות (מחזוריות) בסינתזת פפטיד מוצקה-(SPPS)

התהליך כוללחזרה על מחזור הסרת ההגנה → צימוד → כביסה, מוסיףחומצת אמינו אחת למחזורלהאריך בהדרגה את שרשרת הפפטידים. אחרי כל אחדתגובת צימוד, השרף הוארָחוּץ(למשל, עם ממיסים כגון DMF או DCM) להסרת ריאגנטים שלא הגיבו, תוצרי לוואי ועודפי חומצות אמינו. הלאחר מכן מסירים את ההגנה על -קבוצת האמינו של השאריות החדשות שנוספו, חשיפת אמין חופשי כדי להתכונן לתגובת הצימוד הבאה. מחזור זה חוזר על עצמו עד להרכבה מלאה של רצף הפפטידים הרצוי.

 

6. מחשוף בסינתזת פפטיד מוצק-(SPPS)

ברגע ששרשרת הפפטידים הגיעה לאורך הרצוי, היא כןמבוקע מהתמיכה המוצקהבאמצעות ריאגנט מתאים, בו זמניתהסרת כל קבוצות ההגנה. מגיב מחשוף נפוץ הואחומצה טריפלואורית (TFA), שלא רקשובר את הקשר בין הפפטיד לשרףאלא גםמסיר קבוצות הגנהכגון Fmoc ו-Boc, משחזרים את הפפטיד שלומדינה מולדת. ברגע ששרשרת הפפטידים הגיעה לאורך הרצוי, היא כןמבוקע מהתמיכה המוצקהבאמצעות ריאגנט מתאים, בו זמניתהסרת כל קבוצות ההגנה. מגיב מחשוף נפוץ הואחומצה טריפלואורית (TFA), שלא רקשובר את הקשר בין הפפטיד לשרףאלא גםמסיר קבוצות הגנהכגון Fmoc ו-Boc, משחזרים את הפפטיד שלומדינה מולדת.

באמצעות השלבים הללו,סינתזת פפטידים מוצק-(SPPS)מאפשר אתהרכבה יעילה ומבוקרת של שרשראות פפטידים על תומך מוצק, הימנעות משלבי הטיהור הביניים המסובכים הנדרשים בסינתזה-של פתרונות מסורתיים ובאופן משמעותישיפור יעילות סינתזה ותפוקה.

באמצעות השלבים הללו,סינתזת פפטידים מוצק-(SPPS)מאפשר אתהרכבה יעילה ומבוקרת של שרשראות פפטידים על תומך מוצק, הימנעות משלבי הטיהור הביניים המסובכים הנדרשים בסינתזה-של פתרונות מסורתיים ובאופן משמעותישיפור יעילות סינתזה ותפוקה.