דיון קצר במספר שיטות ייחודיות של סיבים חלולים ב-Inclusion Bod Purification

גופי הכללה (IB) הם חלקיקי חלבון בלתי מסיסים בצפיפות גבוהה, עטופים בממברנות הנוצרות כאשר גנים זרים מתבטאים בתאים פרוקריוטיים, במיוחד ב-Escherichia coli. כאשר נצפה תחת מיקרוסקופ, IB הוא אזור בעל שבירה גבוהה, אשר כמובן שונה ממרכיבים אחרים בציטופלזמה.

יצירת גוף הכללה מורכבת יחסית, קשורה לקצב ייצור החלבון בציטופלזמה, ריכוז הפפטידים החדשים שנוצרו גבוה, ואין מספיק זמן להתקפל, כדי ליצור אגרגטים חלבונים אמורפיים. גופי ההכללה מורכבים בעצם מחלבונים, יותר מ-50% מהם הם מוצרים משובטים. המבנה הראשוני של מוצרים אלה נכון לחלוטין, אך התצורה התלת מימדית שגויה, ולכן אין פעילות ביולוגית. גודל גוף ההכללה הוא 0.5-1מיקרומטר, אינו מסיס במים, מסיס רק בדנטורנטים כגון אוריאה, גואנידין הידרוכלוריד וכו'.

ב-E. coli, גופי הכללה יכולים להתרחש בשני מקומות של התא: ציטופלזמה וציטופלזמה היקפית. המיקום והמאפיינים של גופי הכללה בתא תלויים באופן שבו החלבונים באים לידי ביטוי.

הקוטר של התכלילים בציטופלזמה של E. coli נע בדרך כלל בין {{0}}.2 ל-1.5μm, ולחלבונים שונים יש קטרים ​​שונים, כגון גודל האינטרפרון הוא 0.811μm, וגודלו של prorennet הוא 1.281 מיקרומטר. במקרים מסוימים, הקוטר של חלק מגופי ההכללה גדול מקוטר ה-E. coli, מה שנותן ל-E. coli בליטה. באופן כללי, לתא יש רק גוף הכללה אחד.

 

טיהור גוף הכללה

 

תהליך טיהור גוף ההכללה הוא בדרך כלל:

ריסוק תאים:

הטכנולוגיה הכללית של ריסוק תאים היא: ריסוק רקמות במהירות גבוהה, הומוגניזציה של זכוכית הומוגנית, טיפול קולי, שיטת הקפאה-הפשרה חוזרת, טיפול כימי (בדרך כלל תוך שימוש בטיפול בליזוזים).

 

שטיפת גוף כולל:

גופי הכללה הם חלקיקים מוצקים לא פעילים הנוצרים על ידי צבירה תוך תאית של חלבונים המובעים על ידי חיידקים, אשר קיימים בדרך כלל בצורה אמורפית, בלתי מסיסה. בגוף ההכלה, חלבון המטרה האמיתי מהווה רק כ-50%, והשאר מכיל שומנים, ליפופוליסכרידים, חומצות גרעין והטרופרוטאינים, הקשורים לגוף הכליל ומשפיעים על החידוש של חלבון גוף ההכלה. לכן, כביסה לפני דנטורציה היא שלב הכרחי מאוד.

בנוסף, שטיפת גופי הכללה מועילה להגדלת תפוקת הקיפול מחדש של חלבונים רקומביננטיים. על ידי הסרת זיהומים, ניתן לצמצם מכשולים בתהליך ה-renaturation, כך שניתן יהיה לקפל את החלבון בצורה יעילה יותר ולהרכיב אותה בצורה נכונה, ובכך לשפר את הפעילות והתפקוד של החלבון‌.

כביסה בשימוש נפוץ בפחות מ-1% מחומר הניקוי הנייטרלי, כגון Tween, Triton, Urea ו-NP40 בתוספת EDTA וחומרים מפחיתים 2-מרקפטוטריטול (DTT), -מרקפטואתנול חוזר על עצמו פעמים רבות, מכיוון שכושר הכביסה מוגברת עם הגדלת החוזק היוני של התמיסה, בשטיפה של גופי הכללה ניתן להוסיף NaCl להגברת החוזק היוני.

ניתן להשתמש בגופי הכללה כדי להסיר מרכיבים אחרים של תמיסת פירוק התא על ידי צנטריפוגה או סינון, שניהם מנצלים את היתרונות הפיזיקליים השונים של גופי הכללה.

 

צנטריפוגה:

חלבוני גוף ההכלה צפופים בהרבה מאותו נפח של שברי תאים, ולכן ניתן להפריד את גוף ההכלה משאר התא באמצעות צנטריפוגה. צנטריפוגה רציפה היא הפעולה הנפוצה ביותר להשגת גופי הכללה בייצור תעשייתי. מכיוון שצפיפות שברי התא קטנה מזו של גוף ההכלה, קצב השקיעה קטן מזה של גוף ההכלה. השעיה וצנטריפוגה מתמשכים יכולים לצנטרל את רוב גוף ההכלה, בעוד שברי התאים מוסרים בהדרגה.
סינון (סינון זרימה טנגנציאלית) : בשל הגדלים המולקולריים השונים של גופי הכללה וחלבונים מסיסים, ניתן להשתמש בשיטת הסינון, מה שיכול להפחית את עלויות התפעול ולהקל על הגדלה. סינון זרימה טנגנטיאלית (TFF) מונע על ידי הפרש הלחץ הטרנסממברני. חומרים וזיהומים קטנים מגודל הנקבוביות של הממברנה עוברים דרך הממברנה, בעוד זיהומים כגון תאים עם חלקיקים גדולים יותר נלכדים. פתח הממברנה המשמש בדרך כלל לשטיפת סינון הוא 0.1μm. סינון זרימה משיקית של סיבים חלולים יכולה להתמודד ישירות עם תכולת מוצק גבוהה של חומר נוזלי, פחות שלבים, פעולה פשוטה, ניתן להשתמש בממברנה שוב ושוב באמצעות ניקוי, הפחתת השקעה בציוד ועלויות תפעול, בהתאם לדרישות של ייצור אוטומטי מודולרי.

 

להלן מקרה יישום לשטיפת גוף הכללה באמצעות עמודות סיבים חלולים Guidling.

השתמשנו בסיבים חלולים בגודל 94 ס"מ2 0.1-0.45 מיקרומטר כדי לרכז 250 מ"ל נוזל (משקל חלבון יעד מולקולרי 17 ק"ד). בכל תהליך הכביסה נחקר שיעור ההחלמה של חלבון היעד ודלדול שטף הממברנה.

0-71דקה היא תהליך הריכוז, 71-224דקה היא תהליך הכביסה והסינון. במהלך כל תהליך המיקרו-סינון, TMP גדל בהדרגה, מהירות כניסת הנוזל נותרה ללא שינוי, ושטף החומר הממוצע היה 12LMH.

התוצאות הראו שחלבון המטרה נלכד לחלוטין, ושיעור ההחלמה של חלבון המטרה היה יותר מ-90%. עמודי סיבים חלולים מנחים יציבים ומתאימים ליישום זה.

 

פירוק גוף הכללה:

גופי הכללה מומסים בדרך כלל בתנאים של חומר דנטורציה אוריאה או גואנידין הידרוכלוריד, וחלבוני גוף התכללות המומסים מומסים לחלוטין, כלומר, למעט המבנה הראשוני והקשרים הקוולנטיים נשמרים, כל קשרי המימן והקשרים ההידרופוביים נהרסים, והידרופוביים. שרשראות צד חשופות לחלוטין.

אוריאה וגואנידין הידרוכלוריד הם דנטורנטים בחוזק בינוני, אשר מוסרים בקלות על ידי דיאליזה ואולטרה סינון. הריכוז הכללי של אוריאה 8-10M, guanidine hydrochloride 6-8M. לפירוק אוריאה יש את היתרונות של אי-יינון, ניטרלי, בעלות נמוכה, הסרת חלבון לאחר רנטורציה לא תגרום לכמות גדולה של משקעי חלבון, וניתן לטהר גופי הכללה מומסים במגוון שיטות כרומטוגרפיות, ולכן נעשה בו שימוש נרחב .

 

קיפול מחדש של חלבון גוף:

יש לקפל את החלבון הרקומביננטי המומס בצורה נכונה כדי ליצור חלבון פונקציונלי. טכניקות לשינוי טבעי כוללות דילול של תמיסת חלבון לכמעט ניטרלי, הסרת דנטורנט, חידוש על עמודה וכרומטוגרפיה של סינון ג'ל. ביניהם, דילול תמיסת חלבון לכמעט נייטרלי והסרת דנטורנט היא שיטה קלאסית נפוצה של חידוש טבע, במיוחד לשיטת רסנטורציה בדילול יש את שיעור הניצול הגבוה ביותר.

הסרת דנטורנטים:

דיאליזה: היתרון הוא שהנפח אינו גדל, וקצב ההסרה של הדנטורנט נשלט על ידי הפחתה הדרגתית של ריכוז הנוזל החדיר החיצוני, אך לוקח זמן רב וקל ליצור אגרגטים חלבונים לא פעילים, שאינם מתאימים ל פעולה בקנה מידה גדול ואינה ניתנת ליישום בסולם הייצור.

אולטרה סינון (TFF): קל לשלוט במהירות הדיאליזה, בין אם במחקר ופיתוח, ניסוי פיילוט או ייצור, יכול להסיר דנטורנטים (שינוי נוזל + ריכוז) באמצעות אולטרה סינון (TFF).

 

טיהור חלבון גוף הכללה:

שיטות טיהור החלבון לאחר רנטורציה דומות לאלו של טיהור חלבון מסיס, דהיינו כרומטוגרפיה של חילופי יונים, כרומטוגרפיה של סינון ג'ל, כרומטוגרפיה זיקה, משקעים של אמוניום גופרתי, וכו'.

לגופי הכללה אין פעילות ביולוגית, אין צורך לדאוג מאובדן פעילות החלבון, וכמויות גדולות של ביטוי לא יובילו למוות של תאים, ולמקסם את העמידות להתקפת פרוטאז. ניתן ליישם גמישות סיבים חלולים בתהליך הטיהור במורד הזרם של גופי הכללה. בשלב שטיפת גוף ההכללה, ביצועים מצוינים, בהשוואה לכביסה צנטריפוגלית, השימוש בסיבים חלולים בטכנולוגיית תשע גיל לשטיפת סינון זרימה משיקית יכול לקצר מאוד את זמן התהליך, ושיעור ההחלמה הכללי יכול להגיע ליותר מ-90%. ניתן להשתמש בסיבים חלולים של Jiuling גם בשלב חידוש החלבון של גופי הכללה. העכירות של נוזל ההזנה המסונן על ידי סיבים חלולים במיקרופילטרציה תופחת באופן משמעותי, וקצב התאוששות החלבון גבוה; השימוש בסיבים חלולים עם סינון אולטרה יכול לא רק להסיר דנטורנטים, אלא גם לקצר את זמן טעינת הדגימה הכרומטוגרפית, כדי לחסוך זמן, להפחית את נפח חומר המילוי ולהפחית את עלות הייצור. שיעור ההחלמה של סיבים חלולים מיקרו-סינון/אולטרה-סינון משתנה עם חומרים שונים, ושיעור ההחלמה הכללי יכול להגיע ל-90-95%.

Guidling Technology מברכת אותך לבקש ערכות בדיקה עבור ביקורות קשורות.

 

לגבי Guidling

Guidling Technology הוא מיזם היי-טק לאומי המתמקד בביו-פרמצבטיקה, תרבית תאים, טיהור וריכוז של ביו-רפואה, אבחון ונוזלים תעשייתיים. פיתחנו בהצלחה מכשירי סינון צנטריפוגליים, קלטות אולטרה סינון ומיקרו סינון, מסנן וירוסים, מערכת TFF, מסנן עומק, סיבים חלולים וכו' העונים במלואם על תרחישי היישום של ביו-פרמצבטיקה, תרבית תאים וכן הלאה. הממברנות ומסנני הממברנות שלנו נמצאים בשימוש נרחב בריכוז, מיצוי והפרדה של סינון מקדים, מיקרו-פילטרציה, אולטרה-פילטרציה וננו-סינון. קווי המוצרים הרבים שלנו, החל מסינון מעבדה קטן וחד פעמי ועד למערכות סינון ייצור, בדיקות סטריליות, תסיסה, תרבית תאים ועוד, עונים על צורכי הבדיקה והייצור. Guidling Technology מצפה לשתף פעולה איתך!