תהליך ריכוז אולטרה סינון/דיאפילטרציה במורד הזרם: כיצד למנוע ביעילות חדירת חלבון מטרה ואובדן

תהליך ריכוז אולטרה סינון/דיאפילטרציה במורד הזרם: כיצד למנוע ביעילות חדירת חלבון מטרה ואובדן

בתהליכי טיהור במורד הזרם של חלבונים רקומביננטיים, מוצרי דם ותרופות ביולוגיות אחרות, נעשה שימוש באולטרה סינון/דיאפילטרציה (UF/DF) לריכוז חומרי גלם, חילופי חיץ והסרה של מלחים וזיהומים מולקולות קטנות-. ההפרדה מושגת על סמך סינון ממברנה: מולקולות גדולות כגון נוגדנים חד שבטיים (mAbs) נשמרות על ידי הממברנה, בעוד מלחים, אנדוטוקסינים, חלבוני תאי מארח חופשיים (HCPs) וזיהומים קטנים אחרים של מולקולה עוברים דרך הממברנה ומוסרים בחלל. במהלך תהליך הגדלה-, איבוד חלבון יעד דרך הממברנה יכול להתרחש בקלות, מה שמפחית ישירות את התשואה ומגדיל את עלויות האצווה. בתנאי הפעלה מסוימים, חלבון עשוי להתגלות בחלחלים, מה שמצריך קביעה מהירה אם הרכיבים הדלפים הם mAb מטרה שלמים, אגרגטים מפורקים/מפוצלים או חלבוני תא מארח. מאמר זה מחולק לשני חלקים עיקריים: הוא סוקר את גישות הבקרה המסורתיות של תהליך-, ובשילוב עם Design of Experiments (DOE), יוצר חלון תהליכי חזק, הנתמך על ידי מספר שיטות אנליטיות לקביעת זהות החלבונים שזוהה בחלחלה.

 

 

I. סיבות עיקריות לחדירת חלבון מטרה דרך הממברנה במהלך UF/DF

1. לחץ טרנסממברני מוגזם (TMP)
כאשר הפרש הלחץ על פני הממברנה גבוה מדי, גרר הממס מוגבר, מה שמאלץ חלבון מונומרי כלשהו לתוך החדיר. במהלך -הגדלה, מיכל ההזנה מכיל נפח גדול יותר של חומר ותנודות הלחץ בצנרת בולטות יותר, מה שהופך את הסבירות ללחץ יתר חולף מאשר בקנה מידה מעבדתי.

2. קצב זרימה משיקית לא תקין
אם קצב הזרימה נמוך מדי, נוצרת שכבת קיטוב בריכוז-צפופה על פני הממברנה, וריכוז החלבון המקומי עשוי לחרוג מסף הסובלנות של הממברנה. אם קצב הזרימה גבוה מדי, מתח גזירה עלול לגרום למחשוף מבני של ה-mAb, וליצור שברי חלבון קטנים יותר שיכולים לעבור בחופשיות דרך נקבוביות הממברנה.

3. ריכוז חלבון גבוה מדי בחומר הזנה
כאשר ריכוז החלבון במזון גבוה מדי, חלבון מצטבר על פני הממברנה, וחלק מהחלבון המונומרי עלול להיסחף לתוך החדיר. זו בעיה שכיחה בייצור-בקנה מידה גדול.

4. pH או מוליכות מחוץ לטווח התהליך
שינויים במאפייני המטען של החלבון יכולים להפחית את רדיוס ההידרציה שלו ואת גודל החלקיקים לכאורה, וכתוצאה מכך לחדירת ממברנה לא תקינה.

5. הזדקנות קלטת ממברנה, שטף דיפוזי גבוה או מיזוג מוקדם-לא מספיק
פגמים פיזיים בקלטת הממברנה עלולים לגרום ישירות לדליפת חלבון ולייצג סיכון-לציוד. CIP חוזר עם תמיסות אלקליות חזקות עלול לפגוע בהדרגה בחומר הממברנה של הפוליאתתרסולפון (PES).

6. נפח דיאפילטרציה מוגזם
במהלך דיאפילטרציה ממושכת, שטיפה מתמשכת של ממס יכולה לסחוב בהדרגה כמויות קטנות של חלבון מונומרי.

 

II. אמצעים מעשיים מסורתיים למניעת חדירת חלבון מטרה ואובדן

(א) בקרת פרמטרים של תהליך

1. בקרת לחץ טרנסממברני (TMP)
הגדירו גבול אזהרת לחץ עליון וקבע אזעקות אינטרנעל כדי למנוע השפעות- גבוהות של לחץ גבוה על שכבת הממברנה. לאחר קביעת פרמטרים בסיסיים בקנה מידה קטן, הפחת את לחץ ההפעלה הבטוח במהלך -הגדלת הייצור ושמור טווח סובלנות מתאים לתהליך.

2. ייעל את קצב הזרימה הצולבת
צור שכבת גבול יציבה והפחתת קיטוב הריכוז על פני הממברנה באמצעות זרימה צולבת, ובכך למזער את הצטברות החלבון על פני הממברנה במקור.

3. הגבל את הריכוז הסופי לאחר הריכוז
הגדירו מגבלת ריכוז המבוססת על התכונות הפיזיקליות-כימיות של החלבון והימנעו מריכוז מזון מופרז. עבור mAbs, הריכוז הסופי השגרתי בדרך כלל אינו עולה על 50 מ"ג/מ"ל; עבור mAbs המועדים לצבירה-, יש להפחית עוד יותר את הריכוז.

4. בקרת ה-pH והמוליכות של הזנה
שמור על גודל חלקיקי לחות יציב של החלבון והימנע מהתכווצות מולקולרית הנגרמת מהפרעות בחוזק חומצה/בסיס או-יוני.

(ב) בקרות ציוד והפעלה

1. בצע בדיקת תקינות קלטת הממברנה לפני כל אצווה
בצע בדיקת נקודת- בועות לפני הייצור של כל אצווה כדי לזהות סיבי ממברנה שבורים. יש לזרוק קלטות ממברנות פגומות מיד כדי למנוע דליפת חלבון מתמשכת.

2. תקן את הליך ניקוי CIP
שליטה בריכוז ה-NaOH וזמן המגע. לאחר ניקוי אלקליני חזק, בצע איזון מלא של חומר הממברנה כדי להפחית את הסיכון לעיוות נקבוביות הממברנה.

3. השתמש בדיאפילטרציה מבוימת
השתמש בהחלפת מאגר בנפח- גדול במהלך השלב המוקדם כדי להסיר מלחים, ולהאט את קצב זרימת הדיאפילטרציה ככל שנקודת הקצה מתקרבת כדי להפחית גרירת חלבון ואובדן.

 

III. הקמת מרחב עיצוב תהליך באמצעות DOE (אפיון תהליך QbD; ישים להגשת IND)

1. סינון פקטור
מסך חמישה פרמטרים עיקריים של תהליך UF/DF (P): לחץ על פני הממברנה, קצב זרימת הזנה, ריכוז חלבון ראשוני, pH של הזנה וטמפרטורת פעולה.
משתני תגובה: תשואה נשמרת, תכולת חלבון בחלל, שטף ממברנה ואחוז של אגרגטים-מולקולריים- גבוהים.

באמצעות ניתוח מובהקות, זהה את גורמי המפתח התורמים לבריחת חלבון.

2. דוגמנות משטח תגובה
בחר את ארבעת הפרמטרים בעלי המשמעות הגבוהה ביותר כדי לבנות משטח תגובה ולנתח אינטראקציות בין פרמטרים. בתנאי הפעלה רבים, פרמטר בודד עשוי להישאר בטווח המיועד שלו, בעוד השילוב של שני פרמטרים יכול לגרום לחדירת חלבון. לא ניתן לזהות השפעות אינטראקציה מסוג זה באמצעות ניסויים מסורתיים של-גורם-באחד-בכל פעם. בהתבסס על הדגם, הגדירו חלל עיצובי שניתן לתפעול. כל עוד פרמטרי התהליך נשארים בטווח זה, ניתן להבטיח שימור חלבון יעיל בזמן הסרת זיהומים על ידי דיאפילטרציה.

3. אתגר-במקרה הגרוע (נדרש לאפיון התהליך)
בחר פרמטרים של תהליך בקצוות של גבולות ההפעלה כדי לדמות שונות בייצור: מקסימום TMP, קצב זרימה צולבת מינימלית וריכוז חלבון- עליון. ודא שגם בתנאי הפעלה קיצוניים,-איבוד חלבון יעד גדול אינו מתרחש, ובכך עומד בדרישות סקירת CMC.

 

IV. שיטות אנליטיות מרובות לזיהוי חלבונים שהתגלו במחלחל ולהבחין ביעד mAb, שברי פירוק ו-HCP

בהתבסס על יעילות אנליטית, עלויות ותרחישי הגשה רגולטוריים, ניתן לחלק את השיטות לשתי קטגוריות: סינון מהיר ובדיקות אישור. יש לתעדף שיטות מהירות לניטור תהליכים שגרתי; כאשר מתרחשות סטיות חריגות, יש להשתמש בשיטות זיהוי מדויקות.

1. ספקטרופוטומטריית UV (הקרנה מקוונת מהירה; מועדפת לניטור רצפה-שגרתי בחנות)
אספו את החדיר ומדדו את ספיגת ה-A280 שלו. זה יכול רק לקבוע אם חלבון קיים בחלל ולא יכול להבחין בין מיני החלבון. הוא משמש בעיקר לניטור תהליכים שגרתי. ערך A280 עולה ברציפות מצביע על החמרה בדליפת חלבון ודורש השעיה מיידית של דיאפילטרציה וחקירה של התהליך.

2. SDS-אלקטרופורזה של PAGE (שיטת הזיהוי האיכותי הנפוצה ביותר)
השתמש באלקטרופורזה מפחיתה ולא-ת והשווה את מיקומי הפס לאלו של ה-mAb היעד בחומר הזנה:
1) אם מיקום הלהקה תואם לחלוטין ל-mAb היעד, mAb שלם חלחל לממברנה.
2) אם מופיעות פסי משקל-מולקולריים- נמוכים יותר, החלבון עבר ביקוע הידרוליטי, ויצר שברי mAb.
3) אם הרצועות מפוזרות עם רצועות שונות מרובות, רובן חלבוני תאי מארח (HCPs) מתאי מארח E. coli/CHO ולא ממוצר היעד.

3. כרומטוגרפיה של-ביצועים גבוהים בגודל-אי הכללה (HPSEC)
הפרד רכיבים לפי גודל מולקולרי והשווה את זמני הפליטה שלהם לאלו של כרומטוגרמת חומר הזנה:
- שיא ראשי עם זמן שמירה זהה לזה של ה-mAb מציין חלבון יעד שלם.
- שיא שנפלט מוקדם יותר מצביע על אגרגטים/קטעים בעלי משקל-מולקולרי- גבוה.
- שיא שנפלט מאוחר יותר מצביע על שברי פירוק-מולקולרי- נמוך במשקל.
- היעדר שיא ראשי אופייני מצביע על חלבוני טומאה ב-HCP.
שיטה זו יכולה לספק נתונים כמותיים וניתן לכלול אותה בדוחות חקירת סטיית תהליכים; יש לו קבלה גבוהה בחומרי הגשה קליניים.

4. בדיקת ערכת ELISA של חלבון תאים מארח HCP-
אם מזוהה חלבון בחלחלה, תוצאת ה-ELISA מוגברת, ו-HPSEC לא מראה שיא mAb אופייני, בעצם ניתן לקבוע שהחומר שדלף הוא חלבוני מארח CHO-. זה מצביע על הסרת טומאה לא מלאה במהלך טיהור במעלה הזרם; הזיהומים נשטפים במהלך שלב UF/DF ואינם מייצגים אובדן מוצר.

5. אימות כרומטוגרפיית זיקה (כרומטוגרפיה של חלבון A)
חלבון A קושר באופן ספציפי את אזור Fc של mAbs. טען את דגימת החדיר על העמוד: הופעת שיא אלוציה אופייני מצביע על נוכחות של נוגדן מטרה שלם; היעדר שיא אלוציה מוכיח שהחלבונים בחלל הם כולם חלבוני טומאה.

6. ספקטרומטריית מסה (LC-MS) (עקיבות-מעמיקה; משמש לחקירה של סטיות תהליכיות גדולות)
LC-MS יכולה לנתח ישירות את רצף חומצות האמינו ולקבוע במדויק את מקור החלבון. הוא משמש בעיקר לחקירה של סטיות קשות או חריגות ואינו משמש כבדיקה שגרתית ב-בקרת תהליכים.

V. פעולות תיקון המתאימות לתוצאות אנליטיות שונות

1. mAb מטרה שלם שזוהה בחלחלה
הפחת את הלחץ הטרנסממברני ואת הריכוז הסופי לאחר ריכוז; לצמצם את טווח הפעולה של התהליך בהתבסס על תוצאות DOE; ולבדוק את תקינות קלטת הממברנה.

2. שברי פירוק נוגדנים זוהו בחלחלה
חקור את מתח הגזירה לאורך התהליך ואת קיצוני ה-pH; לייעל את שלב ההשבתה הוויראלית במעלה הזרם כדי להפחית את מחשוף החלבון.

3. רק חלבוני טומאה של HCP זוהו בחלחלה
אין צורך בהתאמה של פרמטרי UF/DF. עקבו אחר הבעיה חזרה לשלבי הכרומטוגרפיה הקודמים ושפר את הסרת הטומאה במהלך כרומטוגרפיית זיקה ו-חילופי יונים.

 

VI. תַקצִיר

כדי למנוע דליפת חלבון במהלך UF/DF, בקרת תהליכים מסורתית מסתמכת על ניסיון היסטורי כדי להגדיר פרמטרים נקודתיים בודדים, שיכולים לתת מענה נאות רק לייצור יציב בקנה מידה קטן-. כדי להבטיח ביצועים יציבים במהלך-הגדלה שלבית של תהליך, יש להשתמש באפיון תהליכים מבוסס DOE- כדי ליצור מרחב עיצוב תהליך עם סובלנות מספקת. בקרת פרמטרים מבוססת-מרווחים יכולה לפצות על שונות בייצור. ברגע שמזהים חלבון בחלל, מערכת זיהוי UV פשוטה יכולה לספק אזהרה ראשונית, ולאחריה אלקטרופורזה, HPSEC ו-ELISA לעקיבות וזיהוי. זה מאפשר הבחנה מדויקת בין מוצר היעד לבין זיהומי-תא המארח, מה שמאפשר חקירה ופעולות מתקנות של שורש-ממוקד. זהו גם רכיב מחקר סטנדרטי הכלול כיום בתיעוד CMC עבור פרויקטים של mAb.