ניתוח מלא של תהליך ייצור תרופות MRNA: כיצד טכנולוגיית TFF פותרת אתגרי טיהור

בשנים האחרונות, טכנולוגיית ה-mRNA השיגה התקדמות פורצת דרך בתחום הביו-פרמצבטי, והדגימה פוטנציאל יישום אדיר, במיוחד בחיסונים ובריפוי גנטי. הפיתוח המוצלח של חיסוני mRNA לא רק סיפק פתרונות חדשים למניעה ובקרה של מחלות זיהומיות, אלא גם הניע את ההתקדמות באימונותרפיה בסרטן וברפואה מותאמת אישית. כמחלקה חדשה של מוצרים טיפוליים, ייצור mRNA בקנה מידה גדול הוא מאתגר מאוד, הכולל שליטה על יציבות ה-RNA, הסרת אנזימים שאריות ותגובה על ידי-מוצרים, החלפת חיץ והשגת שיעורי התאוששות גבוהים של-טוהר, כולם דורשים פתרונות ייצור{5} מאושרים{5}.

תהליך הייצור של חיסוני mRNA או תרופות טיפוליות מחולק בעיקר לשלושה שלבים: הכנת תמיסת DNA בכמות גדולה של פלסמיד, הכנת תמיסת mRNA בתפזורת והכנת מוצר תרופתי mRNA-LNP.

תרשים זרימה של תהליך ייצור תרופות mRNA

 

סינון זרימה טנגנטיאלית (TFF), כטכנולוגיית הפרדת ממברנות מבוססת-, מיושמת באופן נרחב בייצור mRNA בשל יכולת הסינון המולקולרית היעילות הגבוהה-, חילופי המאגר הניתנים לשליטה ומאפייני מתח הגזירה הנמוכים. בהתבסס על עיצוב מודול ממברנה, תצורות TFF נפוצות כוללות-קלטות גיליון שטוחות ומודולי סיבים חלולים-. בנוסף, הפרדת ממברנה מונעת בלחץ ב-TFF יכולה להיות מסווגת למיקרו-פילטרציה (MF), אולטרה-פילטרציה (UF), ננו-פילטרציה (NF) ואוסמוזה הפוכה (RO) לפי גודל נקבוביות הממברנה, עם סלקטיביות הולכת וגוברת.

 

TFF ממלא תפקיד קריטי לאורך שלבים מרובים של ייצור תרופות mRNA, כולל הכנת כמות גדולה של DNA פלסמיד, ייצור בכמות גדולה של mRNA, והניסוח הסופי של מוצרי תרופות mRNA-LNP. באמצעות בחירה מתאימה של סוג הממברנה, חיתוך המשקל המולקולרי-(MWCO) וחומר הממברנה, TFF מאפשר הסרה יעילה של תגובה על ידי-מוצרים וזיהומים בעלי משקל-מולקולרי- נמוך, ובמקביל גם מקל על חילופי חיץ וריכוז לפני ואחרי אנקפסולציה של LNP. זה משפר באופן משמעותי את טוהר ה-RNA, את היציבות ואת מדרגיות התהליך הכוללת.

 

בנוסף, הביצועים של סינון זרימה משיקית מושפעים מגורמי תצורת המערכת כגון סוג המשאבה ותכנון הצינורות, כמו גם פרמטרים מרכזיים של תהליך כולל לחץ טרנסממברני (TMP), מתח גזירה ושטף סינון. יש לבחור בקפידה גורמים אלה ולבצע אופטימיזציה על סמך המאפיינים של מוצר היעד, במיוחד עבור מוצרים רגישים ללחץ- כגון mRNA-LNP, הרגישים מאוד לכוחות מכניים חיצוניים במהלך העיבוד.

 

טיהור של DNA פלסמיד

הכנת פתרון מלאי ה-DNA של פלסמיד מבוססת ביסודה על עיצוב הרצף של תבנית השעתוק. שיטות ההכנה כוללות בדרך כלל הגברה של DNA של פלסמיד, אם כי ניתן להשתמש גם בהגברת PCR. אם לוקחים כדוגמה הגברה של DNA, מהונדסE. coliמשמש בדרך כלל להגברה מבוססת-תסיסה. תהליך הטיהור במורד הזרם כולל בעיקר איסוף תאים, תמוגה והבהרה, ריכוז וחילופי חיץ, סינון סטרילי, לינאריזציה וטיהור כרומטוגרפי. בהגדרות תעשייתיות, צנטריפוגה רציפה של-זרימה משמשת לעתים קרובות לאיסוף תאים, אך היא מייצרת כוחות גזירה גבוהים יחסית. מערכות סיבים חלולים, עם התעלות הפתוחות והגזירה הנמוכה שלהן, מתאימות יותר לטיפול בדגימות בעלות תכולת מוצקים גבוהה, צמיגות גבוהה או רגישות לגזירה, כמו DNA פלסמיד. לאחר האיסוף, התאים נתונים להומוגיזציה בלחץ גבוה-, אולטרסאונד או תמוגה בסיסית, ולאחר מכן בירור ראשוני באמצעות סינון לעומק.

 

כדי להקל על כרומטוגרפיה שלאחר מכן, סינון זרימה משיקית (TFF) באמצעות קלטות ממברנה או עמודות סיבים חלולים עם קיצוץ של משקל מולקולרי-של 30 kDa, 100 kDa או 300 kDa משמש תחילה תחילה לריכוז והחלפת חיץ. זה מקטין את נפח הדגימה ובו זמנית מסיר כמה זיהומים כגון RNA, חלבוני תא מארח (HCP) ושברי DNA של תא מארח (HCD). כרומטוגרפיה משמשת כשלב טיהור הליבה. בדרך כלל, כרומטוגרפיה של חילופי אניונים (AEX) משולבת עם כרומטוגרפיה של אינטראקציה הידרופובית (HIC) כדי להסיר ביעילות זיהומים ולהעשיר DNA של פלסמיד בעל כריכה ביו-אקטיבית ביותר, ובכך לשפר משמעותית את טוהר הפלסמיד.

 

לאחר הטיהור, הפלסמיד נתון ל- TFF שוב כדי לרכז את התמיסה לריכוז היעד (בדרך כלל 0.5-2 מ"ג/מ"ל) ולבצע דיאליזה עם חיץ האחסון הסופי. שלב זה מסיר מלחים שאריות וממיסים אורגניים מהתהליך, ומבטיח שמערכת החיץ עומדת בדרישות לתגובות שעתוק במבחנה במורד הזרם (IVT).

 

טיהור של mRNA מתומלל במבחנה (IVT).

שעתוק במבחנה (IVT) ושינוי הם תהליכי המפתח להכנת תמיסות מלאי mRNA. במהלך ייצור ה-IVT mRNA, נעשה שימוש בשילוב של סינון זרימה משיקית (TFF1) - כרומטוגרפיה - סינון זרימה משיקית (TFF2). אסטרטגיה זו מבטיחה טיהור יעיל ואיכותי- של mRNA, ומספקת תמיכה קריטית לייצור חיסונים.

לאחר השלמת תגובות השעתוק והשינוי, מתבצעת בדרך כלל תחילה סינון אולטרה/דיאה באמצעות קלטות ממברנות או עמודות סיבים חלולים עם קיצוץ של משקל מולקולרי- של 30 kDa, 100 kDa או 300 kDa. שלב זה מסיר ביעילות זיהומים שונים הקשורים לתהליך- ממערכת התגובה, כגון RNA פולימראז, שברי DNA שיוריים, NTPs שלא הגיבו, אנזימים מכסים, RNA דו-גדילי (dsRNA) ומעכבי מולקולות קטנות{{7}, תוך השגת חילופי חיץ בו-זמנית. לאחר שלב סינון זרימה משיקית אחת, רוב הלכלוכים מוסרים ביעילות, ושארית הטומאה היחידה הניתנת לזיהוי היא RNA פולימראז.

לאחר מכן, טכניקות כרומטוגרפיה מרובות מיושמות לטיהור נוסף. השיטות הנפוצות כוללות כרומטוגרפיה זיקה, כרומטוגרפיה של-אי הכללה בגודל, -כרומטוגרפיה הפוכה של צמדים-יונים וכרומטוגרפיה של חילופי יונים-. באמצעות שילוב זה של סינון אולטרה וכרומטוגרפיה רציפה, ה-mRNA משיג רמת טוהר גבוהה.

 

כדי לעמוד בדרישות הניסוח או האחסון, תמיסת המניות של ה-mRNA שוב מרוכזת או מדוללת באמצעות קלטות ממברנה של 30 kDa, 100 kDa או 300 kDa או עמודות סיבים חלולים כדי להתאים במדויק את ריכוז היעד ולהחליף למאגר הניסוח הסופי. לבסוף, סינון סטרילי- מיושם כדי לשלוט בעומס המיקרוביאלי, להשלים את האחסון והמילוי הזמניים של החומר.

Exploration of TFF-related process parameters: Relevant studies have shown that a membrane with a molecular weight cut-off (MWCO) of 100 kDa provides the optimal purification efficiency; the transmembrane pressure (TMP) should not exceed 5 psi; and an mRNA concentration of 1 mg/mL ensures a relatively high permeate flux (>25 LMH).

 

טיהור של ניסוחי mRNA-LNP

חלקיקי ליפידים (LNPs) הם כיום מערכת האספקה ​​הנחקרת ביותר עבור טיפולי mRNA. נכון לעכשיו, ניסוחי mRNA-LNP שונים נמצאים בשלבים שונים של התפתחות פרה-קלינית וקלינית. LNPs רגישים מאוד לתהליכי ייצור. בין פעולות היחידה הנדרשות לייצור mRNA-LNP, ריכוז וחילופי חיץ באמצעות סינון זרימה משיקית (TFF) כמו גם סינון סטרילי מהווים אתגרים משמעותיים. יש לבצע אופטימיזציה של שלבים אלה בקפידה כדי להבטיח מדרגיות תהליך ואיכות מוצר, תוך הימנעות מבעיות כגון עכירות ממברנות וטעינת מסננים שגויה.

 

לאחר עטיית mRNA, סינון זרימה משיקית (TFF) משמש לטיהור. מטרת שלב זה היא להסיר mRNA לא מכוסה, פולימרים חופשיים או חומרים שומנים, כמו גם ממיסים שאריות מ-mRNA ושומנים. מכיוון ש-mRNA-LNPs מפגינים יציבות מוגבלת בטמפרטורת החדר, אופטימיזציה של תהליכים במורד הזרם, כולל TFF, היא קריטית לשמירה על איכות המוצר.

כיווני אופטימיזציה עיקריים כוללים: הגדרה מתאימה של הלחץ הטרנסממברני (TMP) וקצב הזרימה המשיקית בהתבסס על גודל החלקיקים והיציבות של ה-mRNA-LNPs כדי לאזן בין יעילות הסינון לבין מתח החלקיקים; בחירת ממברנות או עמודות סיבים חלולים עם קיצוצים- מתאימים במשקל מולקולרי (MWCO, למשל, 100 kDa או 300 kDa) להסרה יעילה של mRNA חופשי, זיהומים וחילופי חיץ תוך מזעור ספיחת חלקיקים או נזק; ואופטימיזציה של נפחי הריכוז והדיאפילטרציה כדי להבטיח חילופי חיץ יעילים לניסוח היעד ולשלוט בריכוז ובפיזור החלקיקים הסופיים.

 

בנוסף, יש לעקוב מקרוב אחר תכונות איכות קריטיות (כגון גודל חלקיקים, אינדקס פולידיספרסיטי [PDI] ויעילות כיסום mRNA) במהלך התהליך, ולהתאים פרמטרים באופן דינמי על סמך נתוני-זמן אמת כדי להשיג טיהור וניסוח יציבים, מדרגיים ויעילים של LNPs-mRNA.

 

בנוסף, עקב חוסר היציבות של -LNPs mRNA ומרכיביהם בשיטות עיקור סופניות, מסנן סטרילי- בדרגה 0.2 מיקרומטר משמש בדרך כלל להסרת חיידקים ומזהמים מיקרוביאליים אחרים.