מחקר על החלפת כרומטוגרפיית עמודות מסורתית בכרומטוגרפיה ממברנה לטיהור נוגדנים חד-שבטיים
כרומטוגרפיית מיטה ארוזה- מסורתית היא בוגרת ואמינה, אך היא מוגבלת על ידי מגבלות כגון יעילות דיפוזיה נמוכה, לחץ אחורי גבוה ומהירויות עיבוד איטיות, מה שמקשה יותר ויותר לעמוד בקצב התפוקה ההולכת וגוברת של תהליכים במעלה הזרם. לאחרונה פורסם מחקר בהתקדמות ביוטכנולוגיההביאה לפריצת דרך פוטנציאלית לתעשייה: עם היתרונות שלה של פרודוקטיביות גבוהה במיוחד ועמידות איתנה, כרומטוגרפיה של ממברנות עשויה להפוך לחלופה יעילה לכרומטוגרפיה של מיטה-ארוזה ולעצב מחדש באופן יסודי את הנוף של טיהור mAb במורד הזרם.
רקע מחקר
המחקר העריך באופן שיטתי סוגים שונים של מכשירי כרומטוגרפיה של ממברנות, כולל ממברנות חילופי יונים וממברנות זיקה לחלבון A, וערך השוואה מקיפה עם כרומטוגרפיה מסורתית של מיטה ארוזה- על פני מימדים מרובים, כולל יכולת קשירה, פינוי זיהומים, חיי שירות וביצועי טיהור כלליים. שלושה חלבונים רקומביננטיים נבחרו למחקר -נוגדן חד שבטי אחד (mAb) ושני Fc-חלבוני היתוך- המכסים את תהליך הטיהור המלא במורד הזרם מלכידה ועד ליטוש. תוצאות המבחן העיקריות הן כדלקמן:
1. שלב לכידה: כרומטוגרפיית ממברנה חלבון A - קיבולת כריכה גבוהה בזמני שהייה קצרים
כרומטוגרפיה של חלבון A היא שלב קריטי בלכידת mAb. המחקר העריך את הביצועים של ארבע ממברנות חלבון A (שלושה מוצרים מסחריים וקרום אב טיפוס אחד) מול שני שרפי מיטה ארוזים-.
- קיבולת כריכה דינמית יוצאת מן הכלל (DBC):שתי ממברנות השיגו ערכי DBC העולים על 50 גרם/ליטר. חלק מהממברנות שמרו על כושר קשירה של 35-65 גרם/ליטר אפילו בזמן שהייה קצר במיוחד של 0.2 דקות, דומה לשרף המיטה המסורתי- (37-55 גרם/ליטר).
- עלייה דרמטית בפריון:זמן השהייה של כרומטוגרפיית ממברנות היה רק 1/6-1/30 מזה של כרומטוגרפיית עמודות מסורתית (0.13-0.33 דקות לעומת . 2-6 דקות), וכתוצאה מכךגידול של פי 12-35 בתפוקת עיבוד אצווה.
- התאוששות יציבה:התאוששות החלבון עלתה על 85% עבור כל מכשירי הממברנה. ממברנת GORE השיגה את ההתאוששות הגבוהה ביותר של 96%, דומה למעשה לשרף המיטה המסורתי- (94-98%).
- מגבלות שיש לקחת בחשבון:כרומטוגרפיה של ממברנה הפיקה נפח אלוציהגבוה פי 1.4-5מאשר שרפי מיטה ארוזים- מסורתיים, בעוד שסילוק ה-HCP היה נמוך במקצת. עבור חלק מהממברנות, רמות ה-HCP באלואט הגיעו ל-7,000 ppm, בהשוואה ל-4,700 ppm עבור שרפי מיטה ארוזים- מסורתיים. לָכֵן,ייתכן שיידרשו שלבי ליטוש נוספים כדי לפצות על מגבלה זו.
2. שלב הליטוש: ממברנות-יונים/מולטי-מודאליות - הסרת זיהומים יעילה עם עיבוד מהיר
המטרה העיקרית של שלב הליטוש היא להסיר שאריות של זיהומים כגון אגרגטים -מולקולריים- גבוהים (HMW) וחלבוני תא מארח (HCP). המחקר העריך שלושה סוגים של כרומטוגרפיה של ממברנות: חילופי אניונים (AEX), חילופי קטונים (CEX) וממברנות מולטי-מודאליות (MM).
- שיא-פרודוקטיביות:זמן השהייה לכרומטוגרפיה של הממברנה היה בלבד0.17 דקות, בהשוואה ל2-4 דקותעבור כרומטוגרפיה עמודה מסורתית, המייצגת אהפחתה של פי 12-24 בזמן השהייהועלייה דרמטית ביעילות העיבוד.
- פינוי זיהומים דומה לכרומטוגרפיה מסורתית של עמודות:הושגה כרומטוגרפיה של ממברנהמקדמי סילוק HMW של 4.2–5.5, מתקרב לביצועים של שרף Capto Adhere (6). המקדם סילוק HCP הגיע עד ל-60, עם כמה ממברנות שעולות על כרומטוגרפיה מסורתית של-מיטות ארוזות.
- שחזור חלבון תחרותי:רוב הממברנות הושגוהתאוששות חלבון מעל 90%, ולחלק מחלבוני היתוך Fc-, ההחלמה הייתה אפילו גבוהה יותר מזו שהתקבלה בכרומטוגרפיה מסורתית של עמודות.
3. אימות תהליך מלא-: כרומטוגרפיית ממברנה מאפשרת טיהור-בטוהר גבוה
המחקר הקים אתהליך טיהור משולב-ממברנה המשלב לכידת חלבון A עם ליטוש, וקבע אותו ישירות מול תהליך כרומטוגרפיה ארוזה-של מיטה קונבנציונלית:
- ביצועי-טוהר גבוהים:בעקבות תהליך הטיהור המבוסס על הממברנה המלאה, רמות HCP בחלבוני היתוך Fc- הופחתו למתחת ל-50 עמודים לדקה, עם אגרגטים (מיני HMW) בפחות או שווה ל-0.5%. עבור הנוגדן החד שבטי, HCP הופחת ל226 עמודים לדקה, עם אגרגטים ב1.0%, מתקרב לביצועים של תהליך הכרומטוגרפיה של המיטה-ארוזה הקונבנציונלית (11 ppm HCP ו-0.7% מצטברים).
- התאוששות כללית גבוהה יותר:הגיעה ההתאוששות הכוללת של חלבון ההיתוך Fc-89%, שהיהגבוה ב-19%.מזה של תהליך הכרומטוגרפיה של המיטה-ארוזה הקונבנציונלית. לגבי הנוגדן החד שבטי, ההחלמה הייתה73%, דומה לתהליך המיטה הארוז-הרגיל.
- התנגדות עכבה חזקה:כרומטוגרפיה של ממברנה הראתה סבילות טובה יותר לחומרי הזנה בעלי עומסי זיהומים גבוהים ונשארה יעילה גם כאשרריכוז HCP הראשוני הגיע ל-150,000 ppm.
4. חיי שירות: פעולה יציבה עבור 100+ מחזורים עומדת בדרישות הייצור
עמידות הממברנה היא גורם קריטי ליישום תעשייתי. המחקר העריך את יציבות הממברנה דרך201 מחזורי פעולה רצופים:
- חיי מחזור מורחבים:שבעה מתוך שמונת הממברנות הושלמויותר מ-100 מחזורים, בעוד שאב הטיפוס הרב-מודאלי (MM) הגיע201 מחזוריםללא ירידה משמעותית בביצועים.
- ביצועים יציבים:במהלך לימודי הרכיבה על אופניים,התאוששות החלבון נותרה בסביבות 90%, ללא ירידה משמעותית בביצועי הסרת HMW או HCP. גם פרופילי הלחץ נשארו יציבים.
- מתאים ליישומי ייצור:רוב הממברנות היו מסוגלות לתמוךלפחות מחזור ייצור שלם אחד, בעוד שחלקם יכולים לתמוך במספר אצוות. ניתן להפחית עליות לחץ מצטברות על ידי אופטימיזציה שלאסטרטגיית נקיון-ב-מקום (CIP)..
דגשים טכניים: מדוע כרומטוגרפיית ממברנה יכולה להחליף את כרומטוגרפיית העמודים המסורתית?
יתרונות הליבה של כרומטוגרפיית ממברנה נובעים ממבנה הממברנה השטוחה-היחודית שלה. בהשוואה לשרף כרומטוגרפיה נקבובי קונבנציונלי, כרומטוגרפיה של ממברנה מציעה שלושה הבדלים מרכזיים:
- מנגנון העברת המונים חדשני:ממברנות מסתמכות בעיקר על העברת מסה הסעה, ומבטלת את הצורך של חלבונים להתפזר לתוך מדיה נקבוביות. זה מקצר משמעותית את זמן השהייה ומאפשר עיבוד מהיר בהרבה.
- לחץ גב נמוך משמעותית:מבנה הגיליון השטוח- מספק התנגדות זרימה נמוכה ויכול להכיל קצבי זרימה גבוהים יותר, תוך התגברות על מגבלות הלחץ האחורי הקשורות בדרך כלל לכרומטוגרפיה מסורתית של עמודות.
- יכולת הסתגלות חזקה לתהליך:כרומטוגרפיה של ממברנה תואמת לייצור מתמשך ויכולה להתאים טוב יותר את הפרודוקטיביות הגבוהה של תהליכים במעלה הזרם. בנוסף, טביעת הרגל הקטנה יותר של הציוד ודרישות המדיה הממברנות הנמוכות יותר יכולות לסייע בהפחתת עלויות הייצור הכוללות.
כמובן שגם לכרומטוגרפיה של הממברנה יש מגבלות מסוימות. אלה כולליםנפחי פליטה גדולים יותר, הדורשים צריכת חיץ נוספת; הצורך בשיפור נוסף בפינוי הטומאה עבור דגימות מאתגרות כגוןנוגדנים דו-ספציפיים (bsAbs); וזמינות מוגבלת של חלק ממוצרי הממברנה בהיקפי ייצור גדולים. עם זאת, ניתן להתמודד עם אתגרים אלו בהדרגה באמצעות עיצוב ציוד אופטימלי, שילוב שלבי סינון עומק- נוספים ושיפורי תהליכים אחרים.
השפעת התעשייה: ייצור נוגדנים חד-שבטיים נכנס לעידן של טיהור-ביעילות גבוהה
ממצאי מחקר זה מספקים לתעשיית הביו-פרמצבטיקה כיוון ברור להתקדמות טכנולוגית. עבור תהליכי טיהור חלבון היתוך של mAb ו-Fc- קונבנציונליים שמתעדפים פרודוקטיביות גבוהה,לכרומטוגרפיית ממברנה יש פוטנציאל להחליף באופן מלא את כרומטוגרפיית העמודות המסורתית-. אפילו עבור חומרי הזנה מורכבים יותר, אסטרטגיית שילוב באמצעות כרומטוגרפיה ממברנה יחד עם שרפי כרומטוגרפיה קונבנציונליים יכולה לסייע בהשגת איזון אופטימלי בין יעילות העיבוד לטוהר המוצר.
ככל שטכנולוגיות חומרי הממברנה ממשיכות להתקדם, התפתחויות עתידיות צפויות לצמצם עוד יותר את צריכת המאגר ולשפר את המדרגיות, ולהאיץ את תעשיית הביופרמצבטיקה לקראתייצור מתמשך, יעילות-גבוהה וייצור-חסכוני.
עבור יצרני ביו-פרמצבטיקה,אימוץ מוקדם ופריסה אסטרטגית של כרומטוגרפיה ממברנות עשויות להפוך ליתרון תחרותי חשוב בשוק המתפתח.
