טיהור-תעשייתי במורד הזרם של חיידקים - סעיף 'בירור' ו'אולטרה סינון'

בקטריופאג'ים, הידועים גם בשם פאג'ים, הם וירוסים שמדביקים חיידקים. פאג' אינו יכול לשרוד בעצמו; הוא חייב לטפיל חיידק מארח כדי להתרבות, ובסופו של דבר גורם לחיידק להסתלק. בשל תכונותיהם הייחודיות, ניתן להשתמש בפאג'ים באופן קליני לזיהוי והקלדה של חיידקים, כמו גם לטיפול בזיהומים חיידקיים עמידים מסוימים.

זוהי תרשים סכמטי של מבנה בקטריופאג' (מקור תמונה: האינטרנט).

 

ההערכה היא שמחלות צמחים גורמות ליותר מ-30% מאובדני התפוקה העולמית מדי שנה. בין פתוגנים שונים, מחלות חיידקיות קשות במיוחד לשליטה. שיטות בקרה מסורתיות מסתמכות בעיקר על אנטיביוטיקה וחומרים המבוססים על-נחושת. עם זאת, שימוש יתר באנטיביוטיקה הוביל לעמידות לאנטי-מיקרוביאלית חמורה יותר ויותר, בעוד שהשימוש-לטווח ארוך בתרכובות נחושת מביא להצטברות סביבתית, מה שמציב סיכונים בריאותיים לבני אדם ולבעלי חיים.

 

מכיוון שלבקטריופאג'ים יש סגוליות גבוהה, הם יכולים להרוג באופן סלקטיבי חיידקים פתוגניים מבלי לפגוע בחיידקים מועילים או בתאי מארח אחרים. לכן, פאג'ים יכולים לשמש חלופות לאנטיביוטיקה ולסוכנים מבוססי-נחושת. באמצעות טיפול בפאג', ניתן לחסל ביעילות פתוגנים תוך הפחתת השימוש באנטיביוטיקה ובתרכובות נחושת.

 

עם התקדמות מדעית וטכנולוגית מתמשכת ומחקר מעמיק יותר על בקטריופאג'ים, הסיכויים לשימוש בפאג'ים לטיפול בחיידקי על הופכים למבטיחים יותר ויותר. בעתיד, טיפול בפאג'ים צפוי להפוך לאחד הפתרונות המרכזיים לעמידות לאנטיביוטיקה. באמצעות מחקר וחקירה מתמשכים, טיפול בפאג'ים עשוי להופיע ככוח מרכזי בתחום הטיפול האנטי-מיקרוביאלי, תוך תרומה גדולה יותר לבריאות האדם.

 

עם זאת, ניהול בטוח ויעיל של בקטריופאג'ים לגוף האדם-במיוחד באמצעות הזרקה תוך ורידית (IV)-נותר אתגר מרכזי אחד:כיצד להשיג תכשירי פאג'ים-טהורים במיוחד.

ליזאט פאג' הוא תערובת מורכבת שמכילה, בנוסף לפאג'ים היעד, זיהומים עיקריים כגון: חיידקי מארח ושבריהם, DNA גנומי וחלבוני מארח (זיהומים הקשורים למארח-); אנדוטוקסינים כגון ליפופוליסכרידים (LPS) (זיהומים הקשורים לתהליך-); וזיהומים הקשורים למוצר- כולל קפסידים ריקים וזנבות שבורים.

לכן, מטרת הטיהור היא לא רק להשיג טיטר פאג' גבוה אלא גם להפחית זיהומים-במיוחד אנדוטוקסינים, DNA מארח וחלבונים-לרמות נמוכות במיוחד כפי שמצוין בסטנדרטים של פרמקופיה.

תהליך טיהור פאגים חזק וניתן להרחבה עוקב בדרך כלל אחר העקרונות הנפוצים של עיבוד במורד הזרם וניתן לחלקו לשלבים ההגיוניים הבאים:

תהליך טיהור במורד הזרם של בקטריופגים

 

הבהרה - הסרת זיהומים מקרוסקופיים

בשלב הראשוני של טיהור בקטריופאג', המטרה העיקרית של שלב הבירור היא להסיר ביעילות תאי חיידקים שלמים ופסולת תא גדולה מהליזאט הגולמי. מטרת הליבה של שלב זה היא לספק הזנה נקייה לעמודות כרומטוגרפיה במורד הזרם או יחידות הפרדת ממברנות, תוך מזעור העומס של חלקיקים מוצקים. זה מונע למעשה סתימה ביחידות הטיהור הבאות, ומבטיח פעולה יציבה ויעילות תהליכית גבוהה לאורך כל תהליך הטיהור.

בתהליכים מסורתיים של בקטריופאג'ים במורד הזרם, ההבהרה מסתמכת בדרך כלל על צנטריפוגה-במהירות נמוכה בשילוב עם סינון עומק רב-שלבי-עובר בדרך כלל ברצף דרך מסננים של 0.8 מיקרומטר, 0.45 מיקרומטר ו-0.22 מיקרומטר, באופן יעיל ומסיר פסולת תאים{6}. למרות שהיא בוגרת ואמינה, גישה זו כוללת מספר שלבים, היא גוזלת זמן- ודורשת העברות חוזרות ונשנות של חומרים, מה שמותיר מקום לאופטימיזציה בתפוקה וביעילות הכוללת.

 

החלפת סינון העומק הרב-שלבי ב-aקפסולת מיקרופילטרציהיכול לפשט ולהעצים משמעותית את התהליך. באופן ספציפי, לאחר הסרת רוב פסולת התא באמצעות צנטריפוגה-במהירות נמוכה, ניתן לעבד את הליזאט ישירות על ידיסינון זרימה משיקית (TFF)באמצעות קפסולות מיקרו-פילטרציה עם גודל נקבוביות מוגדר (0.45 מיקרומטר או 0.22 מיקרומטר). זה מאפשר הסרה עדינה של זיהומים חלקיקים וחדירה יעילה של פגי מטרה בצעד בודד, שילוב יעיל של שלושת שלבי הסינון המסורתיים לאחד.

חידוש זה לא רק מפחית מאוד את זמן הפעולה והטיפול הידני אלא גם ממזער אובדן דגימה וסיכון זיהום הנגרמים על ידי שלבי סינון מרובים, ובכך משפר את התאוששות הפאג' הכוללת. בינתיים, פעולת הזרימה המשיקית מפחיתה את התכלות הממברנה, משפרת את התפוקה ומחזקת את חוסן התהליך.

 

לכן, אימוץ אאסטרטגיית הבהרה משולבת המשלבת-צנטריפוגה במהירות נמוכה וקפסולות מיקרו-פילטרציהמייצג גישה יעילה לשיפור היעילות והעלות-של ייצור בקטריופאג'ים בקנה מידה גדול-. קפסולות המיקרו-פילטרציה של Guidling Technology יכולות בדרך כלל להפחית את עכירות ההזנה למטה20 NTU, עונה באופן מלא על הדרישות של שלבי סינון וכרומטוגרפיה הבאים.

 

לכידה וריכוז - טיהור ראשוני והפחתת נפח

במהלך הלכידה וריכוזבשלב של טיהור בקטריופאג'ים, המטרה העיקרית היא לשחזר ביעילות פאג'ים מכמויות גדולות של ליזאט מובהר תוך השגת ריכוז מוצר ראשוני וחילופי חיץ בו-זמנית. שלב זה מסתמך בעיקר עלסינון זרימה טנגנטיאלית (TFF)טֶכנוֹלוֹגִיָה.

 

העיקרון של TFF טמון בשימוש בממברנות אולטרה סינון עם קיצוץ- במשקל מולקולרי ספציפי (בדרך כלל 100 או 300kDa). זיהומים מולקולריים קטנים כגון רכיבי חומרי תרבית שיוריים, מטבוליטים וחלבונים קטנים עוברים באופן סלקטיבי דרך נקבוביות הממברנה, בעוד הפאג'ים נשמרים בריטנטט עקבהשפעות של אי הכללת גודל, המאפשר הפרדה והעשרה יעילים שלהם.

בתוך מערכת TFF,מצב אולטרה סינוןמשמש להשגת ריכוז נפח, תוך מעבר למצב דיאפילטרציהמאפשר חילופי חיץ, ובכך ליצור תנאים פיזיקוכימיים מתאימים לשלבים הבאים כגון טיפול אנזימטי.

טכנולוגיה זו מציעה את היתרונות המשולבים שליעילות עיבוד גבוההומדרגיות מעולה, מה שהופך אותו לאידיאלי לייצור-בקנה מידה גדול. על פי GuidlingTechnology, כמוסות האולטרה סינון משיגות בדרך כלל אשיעור התאוששות הפגים של 90-95%, בהתאם לחומר הספציפי המעובד.

 

טיהור עמוק - הסרה ממוקדת של זיהומים קריטיים

בטיהור בקטריופאג'ים,טיהור עמוקהוא שלב המפתח שקובע את איכות המוצר הסופית. המטרה העיקרית שלו היאהסרה ספציפית של זיהומים קריטיים, כגון אנדוטוקסינים. מָסוֹרתִיצנטריפוגה שיפוע צפיפות CsCl-בשל רעילותו וחוסר המדרגיות שלו-הוסר מתהליכים תעשייתיים. הגישות הנוכחיות מתמקדות בטכנולוגיות מבוססות כרומטוגרפיה-, עם שילוב חדשני שלטיפול מקדים באנזים.

 

שילוב אסטרטגיה מתקדמתכרומטוגרפיה של חילופי אניונים (AEC)עִםטיפול מקדים בפוספטאז אלקליין (AP).פותחה. גם הפאג'ים וגם הליפופוליסכרידים (LPS) נושאים מטענים שליליים, מה שמוביל לתחרות על אתרי קישור בתהליכי AEC קונבנציונליים וגורמים ל--שיתוף פעולה המפחית את יעילות הטיהור. על ידי החדרת טיפול מקדים של AP לפני טעינת AEC, האנזים מסיר באופן ספציפי קבוצות פוספט מאזורי השומנים A והפוליסכרידים הליבה של מולקולות LPS, ומפחית באופן משמעותי את המטען השלילי נטו שלהן. זה למעשה מחליש את הזיקה שלהם למדיום חילופי אניונים.

נתונים ניסיוניים מראים כי טיפול במדגם עם20 U/mL APואחריו טיהור באמצעותסופחי ממברנת ליגנד רבעוני אמין (Q) או עמודות מונוליטיותיכול להשיג עד98.8% הסרת אנדוטוקסינים, תוך שמירה על שיעורי התאוששות פאגים מצוינים. גישה זו פותרת בהצלחה את-הבעיה ארוכת השנים של ספיחת שיתוף-אנדוטוקסין במהלך טיהור הפגים

ליטוש - חידוד וניסוח סופיים

 

בגמרשלב הליטוששל טיהור בקטריופאג', המטרה העיקרית היא להשיג טוהר אולטימטיבי ומוכנות לניסוח. זה כולל הסרת שאריות של זיהומים, ביטול תוספים שהוכנסו במהלך התהליך (כגון פוספטאז אלקליין), והחלפה מוחלטת של המוצר למערכת חיץ תואמת-פורמולציה.

זה בדרך כלל מושג באמצעותדיאפילטרציה משנית, שיטה מוכחת ויעילה המאפשרת גם הסרה עמוקה של מזהמים-מולקולות קטנות וגם החלפת חיץ יסודית.

 

כדי לשפר עוד יותר את טוהר המוצר,כרומטוגרפיה של קשרי מימן-אוֹכרומטוגרפיה מעורבת-מצב (MMC)ניתן להציג בתור אשלב הליטוש האחרון. טכניקות אלו משתמשות במנגנוני הפרדה רב-ממדיים להסרת רכיבי עקבות בעלי תכונות פיזיקוכימיות הדומות לאלו של הפאג' היעד. התוצאה היא מרכיב תרופתי פעיל בקטריופאג' (API) מטוהר במיוחד העומד בתקני האיכות המחמירים הנדרשים עבורניסוחים בדרגת הזרקה-.

על ידי בחירת שילוב של מודולי ממברנות מיקרו-פילטרציה ואולטרה-פילטרציה בשטח ממברנה של 1 מ"ר, הנפח המרבי המשוער של בקטריופאג שניתן לעבד מגיע עד ל-100 ליטר. שטף חומרי המיקרו-סינון הוא כ-20-50 LMH, ושטף חומרי האולטרה-סינון הוא כ-15-30 LMH. בהשוואה לשיטות עיבוד מסורתיות, גישה זו יכולה לעמוד ביעילות בדרישות התהליך הן עבור בירור והן עבור סינון אולטרה.

הפניות:

סאוודרה וחב',טיהור ניתן להרחבה של תכשירי בקטריופאג'ים (2025)

לאפראס וחב',רציונליזציה של תהליך הטיהור עבור מרכיב תרופתי פעיל בפאג' (2024)