מחקר על תהליך ההבהרה של תסיסה בצפיפות גבוהה ליזאט של Escherichia Coli רקומביננטי

 

על מנת להפחית את ההפרעה של נוזל החומר לכרומטוגרפיה ולשפר את ההתאוששות של חלבון המטרה, נחקר תהליך ההבהרה של ליזאט תסיסה בצפיפות גבוהה של שני זנים של Escherichia coli רקומביננטי. נבחרו זנים BL21-HP1036 ו-BL21-palA המבטאים גנים מרכזיים של Streptococcus suis ו-Haemophilus parasuis. תהליך זרימה טנגנטיאלית, תהליך צנטריפוגה במהירות גבוהה ותהליך בירור קלטת ממברנות שימשו להערכת תפוקת החלבון על ידי עכירות וזיהוי אלקטרופורזה.

 

התוצאות הראו ש-BL21-HP1036, BL21-palA תסיסה בצפיפות גבוהה המבטאת גנים מרכזיים של Streptococcus suis ו-Hemophilus parasuis הובהרו על ידי סינון קלטת ממברנה וצנטריפוגה, ותפוקת החלבון הייתה מעל 80%, מה שיכול למעשה להפחית את ההפרעה הכרומטוגרפית ולשפר את קצב ההתאוששות.

 

מָבוֹא

נכון להיום, Streptococcus suis (SS) וה-Hemophilus parasuis (HPS) הם הפתוגנים הנפוצים ביותר של מחלות חיידקים בחוות חזירים, אשר מביאים הפסדים גדולים לתעשיית החזירים. ניתן לחלק את ה-SS ל-35 סרוטיפים בסך הכל 1-34 ו-1/2, וניתן לחלק את HPS ל-1-15 סרוטיפים, ולעתים קרובות השניים מעורבים, בעיקר גורמים לפוליסריטיס חזירים, דלקת פרקים, דלקת קרום המוח, אנדוקרדיטיס , ספטיסמיה חיידקית וברונכיטיס.

 

בשל ריבוי הסרוטיפים של Streptococcus suis ו-Haemophilus parasuis, ההגנה ההצלבה בין סרוטיפים שונים חלשה, ועמידות לאנטיביוטיקה תעלה משמעותית בטיפול באנטיביוטיקה, מה שישפיע על ההשפעה הטיפולית.

 

חיסונים הפכו לאחד האמצעים היעילים למניעת SS ו-HPS. ישנם חיסונים מומתים, חיסונים מוחלשים, חיסונים חיים, חיסונים תת-יחידות וחיסונים מהונדסים גנטית, אבל חיסונים מומתים וחיסונים מוחלשים נמצאים בעיקר בשוק, וההגנה החיסונית שלהם טובה, אבל ההצלבה לא ברורה. חיסון תת-יחידות הוא סוג חדש של חיסון נגד סטרפטוקוקוס סויס, שהוא סוג חדש של חיסון עם הגנה צולבת חזקה ומחיר נמוך. המחקר והפיתוח של חיסוני תת-יחידות של Streptococcus suis וה-Haemophilus parasuis מספקים פתרון מושלם לבעיות המניעה והשליטה של ​​Streptococcus suis וה-Hemophilus parasuis הפוקדות את תעשיית החזירים בסין.

 

חיסוני תת-יחידה מסוג Streptococcus suis ו-Hemophilus parasuis נתונים לתסיסה בצפיפות גבוהה על ידי Escherichia coli רקומביננטי. להבהרת הליזאט יש השפעה רבה על תפוקת חלבוני המטרה, אך ישנם מעט דיווחים רלוונטיים. כיצד לממש את שלב ההבהרה של תהליך התסיסה והטיהור היא עבודה חשובה. במאמר זה, רקומביננטי E. coli BL21-HP1036, BL21-palA תסיסה בצפיפות גבוהה כאובייקט, לחקור כיצד להפחית ביעילות את העכירות של תמיסה המבהירה, לשפר את תפוקת החלבון, עבור תהליך התסיסה של חיסון תת-יחידה מסוג Streptococcus suis להשגת טכנולוגיית ריסוק והבהרה תעשייתית כדי לספק בסיס תיאורטי ותמיכה טכנית.

 

1. חומרים ושיטות

1.1 חומרים

 

1.1.1 זנים

זני Streptococcus suis ו- Haemophilus parasuis BL21-HP1036, BL21-pa-lA

 

1.1.2 מדיה וריאגנטים עיקריים

תמצית שמרים ופורפוס; נתרן כלורי; Kanamycin, IPTG; פורמלדהיד מ; ערכת ג'ל SDS-PAGE.

 

1.1.3 ציוד בדיקה ראשי

פרמנטר בצפיפות גבוהה; צנטריפוגה במהירות גבוהה; מכשירי אלקטרופורזה; מערכת הדמיית ג'ל אולטרה סגול; מגרסה אולטראסונית; צנטריפוגה קטנה במהירות גבוהה; ספקטרופוטומטר אולטרה סגול; שולחן רועד בטמפרטורה קבועה; ציוד כרומטוגרפיה זיקה.

 

1.2 שיטות

 

1.2.1 תרבות תסיסה בצפיפות גבוהה

זני הקוליפורם הרקומביננטיים המוסמכים BL21-HP1036 ו-BL21-pa-lA חוסנו על מדיום סינטטי ב-2%(V/V) ותורבבו ב-37 מעלות למשך 35-40 שעות.

 

1.2.2 ביטוי המושרה על ידי חלבון רקומביננטי

כאשר תמיסת התסיסה OD{{0}}±0.1, החלה האינדוקציה, טמפרטורת האינדוקציה הייתה 35 מעלות ±0.5 מעלות, והתרבית הסתיימה לאחר 10 שעות של אינדוקציה.

 

1.2.3 ריסוק הומוגנית בלחץ גבוה וצנטריפוגה

נוזל החיידקים שעבר את מבחן האינאקטיבציה נמחץ על ידי הומוגגניזר בלחץ גבוה לפיצוח תאים בהתאמה, בלחץ של 100~150 MPa. לאחר הריסוק, הנוזל הכתוש נשמר בטמפרטורה נמוכה.

הסופרנטנט הושג על ידי צנטריפוגה במהירות גבוהה, מהירות צנטריפוגלית: 15000 סל"ד, בקרת טמפרטורה: 10 מעלות ~ 15 מעלות, מהירות הזרקה: 0.5~1 ליטר לדקה, בהתאמה, הסופרנטנט נאסף, וה הסופרנטנט היה מלא במיכלים שהסירו אנדוטוקסין.

 

1.2.4 בירור קלטת ממברנת מיקרופילטרציה

הממברנה נשטפה עם 10 ליטר מים מטוהרים בכיוון אחד, ובוצע סינון זרימה משיקית. 300 מ"ל של תרחיף החיידקים השבור לאחר צנטריפוגה נלקחו מצנטריפוגת הצינור והתבררו עם קלטת ממברנת מיקרו-סינון 0.45um. עכירות נמדדה על ידי דגימה בהתאמה, והשוו העכירות לאחר צנטריפוגה, עכירות הנוזל המובהר בקסטת ממברנת המיקרופילטרציה ועכירות הנוזל המרוכז בקסטת ממברנת המיקרופילטרציה. תכולת החלבון של הדגימה זוהתה על ידי כרומטוגרפיה ואלקטרופורזה כדי להעריך את תפוקת החלבון.

 

שלב 2: תוצאות

2.1 נתוני הבהרה ותוצאות בדיקה של חלבון BL21-HP1036 ו-BL21-palA

התוצאות באיור. 1 מראה שהעכירות של נוזל ריסוק BL21-HP1036 ו-BL21-palA רקומביננטי Escherichia coli ירד מ-4 500 NTU ו-4 000 NTU ל-1970 NTU ו-520 NTU, בהתאמה, לאחר צנטריפוגה בצינור. העכירות של BL21-HP1036 ו-BL21-palA Escherichia coli רקומביננטית הופחתה ל-25 NTU ו-1.28 NTU בשיטת קלטת ממברנת מיקרו-פילטרציה. ניתן לראות שלשימוש בסינון זרימה משיקית של ממברנת מיקרופילטרציה ותעלת זרימה פתוחה אופטימלית יש השפעה טובה על הפחתת האנדוטוקסין, צמיגות ועכירות הנוזל הכרומטוגרפי מאשר סינון הצנטריפוגה המסורתי, ויכול להפחית באופן משמעותי את ההטרופרוטאין רקומביננטי E. coli השבור. וחומצת גרעין.

 

2.2 שחזור חלבון של דגימות BL21-HP1036 ו-BL21-palA

טבלה 1 מראה שחלבון Escherichia coli BL21-HP1036 רקומביננטי קיים הן בתמיסת המיקרופילטרציה והן בסופרנטנט המרוכז המכוסה על ידי ממברנת המיקרופילטרציה, ותפוקת החלבון הכוללת לאחר שחזור החלבון מהתמיסה המובהקת במיקרופילטרציה ומהסופרנטנט המרוכז. הוא כ-88.5%. חלבון BL21-palA קיים גם בתמיסה הבהירה של exudate microfiltration ובסופרנטנט של התמיסה המרוכזת המכוסה על ידי קלטת ממברנת מיקרופילטרציה. התשואה הכוללת של חלבון BL21-PALa הייתה 81.5%.

 

3. מסקנה

במאמר זה, הזנים המבטאים את הגנים המרכזיים BL{{0}}HP1036 ו-BL21-palA של Streptococcus suis ו- Haemophilus parasuis בהתאמה עברו תסיסה בצפיפות גבוהה ועברו 0.45 העכירות של נוזל החומר הייתה מופחת משמעותית על ידי תהליך קלטת ממברנות מיקרו-פילטרציה של um, מה שמעיד על כך שטכנולוגיית סינון הזרימה המשיקית עם קלטת ממברנת מיקרו-פילטרציה הייתה טובה יותר מזו עם צנטריפוגה מהירה, ויכולה להפחית משמעותית את חלבון הטומאה וחומצת הגרעין של ה-Escherichia coli השבור.

 

לאחר איסוף הנוזל השקוף בקסטת ממברנת המיקרו-סינון הבודדת, היו 62.9% כמו 37.1% מחלבון היעד של BL21-HP1036 היה תרכיז מיקרו-פילטרציה או שהיה קיים בקסטת ממברנת המיקרו-סינון והפסדים אחרים , אומצה שיטה דו-שלבית להבהרה. בשלב הראשון, נעשה שימוש בקלטת ממברנת מיקרו-פילטרציה בגודל 0.45um כדי להבהיר ולאסוף את האקסודאט; בשלב השני, הנוזל המרוכז שנותר נאסף לאחר צנטריפוגה בצינור, והנוזל הבהיר בשני השלבים שולב כדגימה הכרומטוגרפית. ערך העכירות של נוזל התסיסה BL21-palA לא עלה משמעותית, תפוקת החלבון יכולה להגיע יותר מ-85.5%, ותפוקת החלבון של נוזל התסיסה BL21-Pala יכולה להגיע ל-81.5% לאחר טיפול דו-שלבי.

 

באשר לאופן בחירת קלטת ממברנת המיקרופילטרציה, טכנולוגיית Guidling יכולה לספק לך פתרונות איכותיים. מוצרי סדרת קלטות ממברנות מיקרו-פילטרציה וקלטות ממברנות אולטרה-פילטרציה שלנו משתמשות בפוליאת'ר סולפון כמנשא, שתוכנן במיוחד עבור ביוטכנולוגיה. לממברנת הפוליאת'ר סולפון שלנו יש את היתרונות של תפוקה גבוהה, ספיחת חלבון נמוכה, חוזק מכני גבוה, עמידות בפני פגיעות וכן הלאה. אנו מספקים לך מהדקי ממברנה מיוחדים למדידת הלחץ של הכניסה והיציאה בזמן אמת, ויכולים לספק ביקורים טכניים בהתאם לצרכים שלך כדי להתאים אישית את מערכת האולטרה סינון/מיקרו סינון המיוחדת שלך. מערכת זרימה משיקית קטנה כזו יכולה לשמש לייצור קטן, פיילוט ובקנה מידה קטן, ויכולה להיות הגברה ליניארית מלאה כדי לענות באופן מלא על דרישות הבדיקה ודרישות הייצור שלך.

לגבי Guidling

Guidling Technology הוא מיזם היי-טק לאומי המתמקד בביו-פרמצבטיקה, תרבית תאים, טיהור וריכוז של ביו-רפואה, אבחון ונוזלים תעשייתיים. פיתחנו בהצלחה מכשירי סינון צנטריפוגליים, קלטות אולטרה סינון ומיקרו סינון, מסנן וירוסים, מערכת TFF, מסנן עומק, סיבים חלולים וכו' העונים במלואם על תרחישי היישום של ביו-פרמצבטיקה, תרבית תאים וכן הלאה. הממברנות ומסנני הממברנות שלנו נמצאים בשימוש נרחב בריכוז, מיצוי והפרדה של סינון מקדים, מיקרו-פילטרציה, אולטרה-פילטרציה וננו-סינון. קווי המוצרים הרבים שלנו, החל מסינון מעבדה קטן וחד פעמי ועד למערכות סינון ייצור, בדיקות סטריליות, תסיסה, תרבית תאים ועוד, עונים על צורכי הבדיקה והייצור. Guidling Technology מצפה לשתף פעולה איתך!