טכנולוגיה של השבתה והסרת וירוסים של מוצרי דם

Oct 24, 2024

מוצרי דם הם "רכיבי חלבון פלזמה או רכיבי תאי דם, כגון אלבומין בדם אנושי, אימונוגלובולין אנושי, תרכיז תאי דם אדומים של גורם קרישה אנושי (טבעי או רקומביננטי), וכו', מופרדים מפלסמה אנושית בריאה או פלזמה אנושית חיסונית ספציפית, מטוהרים או עשוי בטכנולוגיית DNA רקומביננטי, לאבחון, טיפול או אימונופרופילקסיה פסיבית". מוצרי דם ממלאים תפקיד חשוב בחירום רפואי, חילוץ פציעות מלחמה ומניעה וטיפול בכמה מחלות ספציפיות.

נוהלי אבטחת בטיחות צריכים להבטיח שהתרופה הסופית בטוחה עבור הרגולטורים ובסופו של דבר עבור החולים והציבור. בשנות ה-90, ועידת התיאום הבינלאומית (ICH 1998) פרסמה את "Q5A: הערכת בטיחות ויראלית של מוצרים ביוטכנולוגיים של קווי תאים ממקור אנושי או בעלי חיים" (Q5A: Viral Safety Assessment), וקבעה תקן עולמי לבטיחות ויראלית.

ICH Q5A מתאר תוכנית רב-שכבתית לבדיקה ואימות ניקוי כדי להשיג מטרה זו. תוכנית הבדיקה מתמקדת בקצירת בנק תאים, חומרי גלם וביו-ריקטור, בתוספת ניתוח סיכונים למוצר. בנוסף לבדיקה, ICH Q5A דורש לטיהור במורד הזרם להיות מוערך כאמצעי בטוח לכשל כאשר לא מזוהים מזהמים במעלה הזרם. אימות אישור מבטיח שאם וירוס כלשהו חומק ממשטר הבדיקות, ניתן להסירו ו/או להשביתו לפני שיגיע למוצר התרופה הסופי.

בייצור ביוטכנולוגיה מודרנית (או ביו-עיבוד), יש בדרך כלל שלוש או ארבע פעולות יחידות בכל הרצף המטוהר, המסוגלות להסיר או להשבית את הנגיף. זה כולל שלבים כרומטוגרפיים מסוימים (כגון חלבון A או החלפת אניונים), תרבית של pH נמוך או חומרי ניקוי, ומסנני שימור וירוסים. לא כל השלבים הללו יסירו או יבטלו ביעילות את כל הווירוסים.

לדוגמה, תרבית pH נמוך בדרך כלל אינה יעילה עבור השבתת וירוס ללא מעטפת, אך היא פועלת היטב עבור השבתת וירוס מעטפת. בתנאי הפעלה מסוימים, ייתכן שעמודת חילופי האניונים לא תוכל לקשור ולהסיר וירוסים איזואלקטריים ניטרליים מזרם המוצר, אך היא יעילה נגד וירוסים חומציים.

זהו שילוב של שלוש עד ארבע פעולות יחידות עצמאיות ואורתוגונליות המבטיחות יחד את בטיחות הנגיפים של מוצרי ביוטכנולוגיה.

ההנחה הכללית היא ששלב עיבוד חזק, יעיל ואמין יוכל להסיר או להשבית מספר רב של וירוסים (מוגדרים בדרך כלל כ-4 log10 ומעלה, כאשר ערך הפחתת היומן או LRV מחושב כ-log10 של הסכום הכולל. מספר הוירוסים בקלט חלקי המספר הכולל של הוירוסים בפלט). עם זאת, ה-LRV אינו יכול לשמש כמדד אבסולוטי יחיד ליעילות של צעד. הנתונים עשויים להיות ראשוניים. קל למודל, יחסית לא רגיש לשינויים בתנאי התהליך, ויעיל נגד מגוון וירוסים (WHO 2004).

סינון ויראלי מוכר באופן נרחב כשלב תהליך כה רב עוצמה ויעיל והוא מרכיב מרכזי באסטרטגיה הכוללת למזער את הסיכון של חלקיקים ויראליים אקסוגניים ואנדוגניים במהלך ייצור מוצרי ביוטכנולוגיה.

מסננים ויראליים פועלים לרוב באמצעות מנגנוני שמירה חזקים מבוססי גודל. בהתבסס על מנגנון פעולה רב עוצמה זה, מסננים ויראליים נוטים יותר מאשר צעדים כרומטוגרפיים לספק שימור ויראלי צפוי למגוון וירוסים. הסיבה לכך היא שהמסנן נוטה פחות להיות מושפע מהבדלים בתכונות הפיזיקליות-כימיות של וירוסים שונים ואינטראקציות וירוס-שרף המוסדרות על ידי תנאי ההפעלה. לכן, שלב הסינון הנגיפי משמש בדרך כלל בתהליכי טיהור חלבונים טיפוליים רקומביננטיים (EMEA 1996), אשר הוכחו כבעלי ביצועים חזקים גם בתעשיית עיבוד הפלזמה.

עם זאת, מוצרי דם הם כמו חרב פיפיות, אשר לא רק מצילה אלפי חיים, אלא גם יש לה אפשרות להפיץ מחלות ולהוות איום על בריאות האדם. לפי הסטטיסטיקה, מ-1977 עד 1984, לפחות 30,000 מקבלי דם בארצות הברית קיבלו דם נגוע בנגיף האיידס. בשנת 1985, 1,200 מתוך 3,000 חולי המופיליה בצרפת נדבקו באיידס באמצעות עירויי דם או מוצרי דם.

לפי ארגון הבריאות העולמי, 5% עד 10% מזיהומי איידס ברחבי העולם נגרמים מעירויי דם או מוצרי דם נגועים באיידס. המקרה הראשון של איידס בסין נדבק על ידי שימוש במוצרי דם מיובאים הנגועים בנגיף האיידס. בנוסף, דווח גם על העברת מחלות הפטיטיס B ו-C עקב עירוי דם ומוצרי דם.

1. וירוסים עיקריים המועברים על ידי מוצרי דם ומאפייניהם

ישנם סוגים רבים של וירוסים המועברים דרך דם ומוצרי דם, כפי שמוצג בטבלה 1. ביניהם, HIV, HBV ו-HCV מודאגים על ידי חוגים רפואיים מקומיים וזרים בגלל שיעור ההדבקות הגבוה שלהם והנזק החמור שלהם.

מכיוון שלדם ולמוצרי דם יש אפשרות להפיץ וירוסים, הוא השפיע קשות על יישומו במניעה וטיפול במחלות. לכן, בייצור מוצרי דם יש להוסיף תהליכי ביטול והסרה של וירוסים כדי להבטיח את בטיחות מוצרי הדם.

2. שיטות עיקריות של ביטול והסרה של וירוס

על מנת להבטיח את בטיחות מוצרי הדם, בנוסף לבחירת תורמי דם, חיסונים במידת האפשר ובדיקות קפדניות של דם שנאסף ואמצעים נוספים, ביטול והסרה של טיפול בנגיף במוצרי דם מהווה חוליה חשובה להבטחת בטיחות עירוי דם. מספר שיטות נפוצות ויעילות להשבתה והסרה של וירוסים מתוארות בפירוט להלן.

הבסיס התיאורטי של שיטה זו הוא שקצב ההרס של מבנה הנגיף גבוה בהרבה מזה של מבנה החלבון באמצעות בחירת הטמפרטורה וזמן הפעולה. תוצאות של כמעט 50 שנים של שימוש קליני וניסויים אחרונים בבעלי חיים אישרו שאלבומין בתמיסה לאחר טיפול חימום של 60 מעלות, 10 שעות, כלומר חיטוי פסטר, יכול לא רק להשבית את HBV, אלא גם להשבית את HCV ואת HIV, מה שהופך את האלבומין לאמין ביותר מוצר דם בבטיחות ויראלית.

לאחרונה, התהליך של פסטר הורחב לייצור של IVIG, FVI, FIX, פיברינוגן ומוצרים נוספים. Bridonnccu et al. הוסיפו את תהליך השבתת הנגיף הזה לתהליך ייצור אתנול בטמפרטורה נמוכה IVIG, כלומר, שיטת Pasteur יושמה בתנאים של ללא מייצב, מלח וחומציות נמוכים, וטיטר הנגיף ירד ב-5 Log. סימונדס וחב'. בדק וירוס מועבר עירוי (TTV) של תכשירים מרוכזים FVⅢ ו-FIX בשימוש קליני בבריטניה, ומצא ששיעור זיהוי ה-TTV של מוצרים ללא השבתת וירוס Pasteur היה 50% עד 75%, ושיעור הזיהוי החיובי של מוצרים לאחר הפסקת Pasteur היה 0.

השיעור החיובי של TTV היה 27% ב-84 חולי המופיליה בבריטניה שהשתמשו במוצרים של גורם קרישה לא מושבת, בעוד שרק 1 מתוך 19 חולים שהשתמשו במוצרי גורם קרישה מומתים של וירוסים היו חיוביים, עם שיעור זיהוי חיובי של 5%. לכן, תהליך השבתת הנגיף יעיל מאוד בשיפור בטיחות מוצרי הדם.

This method was first established by Horowitz et al., a blood center in New York, the principle is that organic solvents can make lipids fall off the surface of the virus, so that the structure of the virus is destroyed and the infection activity is lost. The common S/D method uses n-butyl triphosphate (TNBP) in combination with different surfactants such as Tine80, Triton X100, and sodium cholate. The effect of S/D method on the inactivation of lipid-coated viruses in blood products has been confirmed. For example, when FI concentrated preparations were treated with 0.3%TNBP and 0.2% sodium cholate at 24℃ for 6 h, the inactivation of HBV and HCV was >4 Log,HIV >4.5 Log, and the inactivation of VSV and Sindbis viruses was >4.5 Log, and the recovery rate of FVIII was >90%. מספר רב של מוצרי דם שהושבתו בשיטת S/D הוכחו בטוחים ואמינים באמצעות יישום קליני לטווח ארוך, כך שהם נמצאים בשימוש נרחב. עם זאת, לשיטה זו אין יכולת אי-אקטיבציה נגד parvovirus B19, HEV ונגיפים אחרים שאינם מצופים בליפו.

השבתת חום יבש פירושה שהתכשיר המלובן מטופל על ידי חימום והנגיף נהרג על ידי חום יבש. שיטות חום יבש הנפוצות הן 60 מעלות ~80 מעלות, שיטת חימום של 10~72 שעות ושיטת טיפול של 80 מעלות, 72 שעות. כבר בתחילת שנות ה-80, זה היה שימושי לחמם תכשיר מרוכז ליופיליזציה FVIII וקומפלקס פרוטרומבין ב-60 מעלות ~ 80 מעלות במשך 10 ~ 72 שעות. עם זאת, הוכח ששיטה זו אינה יכולה להשבית לחלוטין את HBV, HCV, HIV. טיפול בחום יבש ב-80 מעלות ו-72 שעות הוכח כיעיל בהשבתת HBV, HCV ו-HIV. היו גם דיווחים אחרונים על תכשירים ליאופילים של גורמי קרישה שטופלו ב-100 מעלות. Xu Jinbo et al טיפלו ב-IgG ב-100 מעלות למשך 30 דקות ובנגיף סטומטיטיס שלפוחית מושבתת 8.2 Log. יש אנשים שיקפיאו את FVIII המיובש ב-68 מעלות למשך 72 שעות, במצב יבש ולאחר מכן יחממו ל-100 מעלות למשך 0.5 ~ 1 שעה. שיטה זו חסכונית יחסית.

This method was first proposed by Matthews et al. The principle is that some photosensitizers have a strong affinity for the surface of the virus and the structure of the viral nucleic acid, and are easily activated under appropriate wavelength of light, thus destroying the structure of the virus in contact with them through photochemical action. The photosensitizers that have been used include: hemacoline derivatives, psoralide derivatives, phenothiazines, phthalocyanines, and cyanine 540, etc. The main feature of this method is that it can be used to inactivate the virus of whole plasma, and the inactivation of the virus of platelet products is the current research focus. Scientists from the Department of Experimental Medicine at the University of California in the United States have screened out a new psoralen derivative S-59 among more than 100 chemical modifications of psoralen. The platelets were irradiated with 150 um S-59 combined with 3 J/cm2 UVA, which could inactivate >6.7 Log of free HIV and >6.6 יומן תאים הקשורים ל-HIV, וטסיות הדם נשארו טובות לאחר 7 ימים של שימור תפקודי במבחנה, אשר אושר על ידי ה-FDA לניסויים קליניים.

בין השיטות הללו, שיטת החיטוי Pasteur ושיטת S/D מאושרות על ידי ה-FDA של ארצות הברית ונמצאות בשימוש נרחב בעולם. שיטת השבתת החום היבש מתאימה בעיקר להשבתת וירוסים של תכשירים ליאופיל. לשיטה הפוטוכימית יש השפעת אי-אקטיבציה חזקה על וירוסים מצופים בשומנים, והיא שימשה בהשבתת וירוס פלזמה שלמה באירופה, ויש לה סיכויים רחבים להשבתת וירוסים ברכיבי תאי הדם. עם זאת, לכל השיטות הללו יש חסרונות משלהן, כגון עיקור פסטר אינו אידיאלי להשבתת כמה וירוסים עמידים בחום; שיטת S/D לא הצליחה להשבית ביעילות את הנגיף שאינו מצופה בליפו. השיטה הפוטוכימית פגעה משמעותית בפעילותם של חלק מחלבוני הפלזמה. השימוש הקליני הנוכחי בחקירות מעקב מראה ששום שיטת השבתת וירוס לא יכולה להבטיח שמוצרי דם נקיים לחלוטין מהסיכון של העברה של וירוסים.

בייצור מוצרי דם, תהליך השבתה אחד לא יכול להשבית את כל הנגיפים; בנוסף, הנגיף עצמו הוא חלבון הטרולוגי, כגון קלט עם המוצר יגרום לתגובות שליליות; יחד עם זאת, בשל מגבלת הרמה הטכנית, עדיין קיימים וירוסים שמאפיינים אינם נמצאים או מובנים, כך ששיטות השבתת הווירוסים הקיימות אינן יכולות להבטיח את השפעת האינאקטיבציה של וירוסים אלו. לכן, ביטול הפעלה בלבד אינו יכול להבטיח את בטיחות המוצר ויש להסירו מהמוצר. אז הטכנולוגיה להסרת וירוסים מקבלת יותר ויותר תשומת לב. שני תהליכים נפוצים ויעילים להסרת וירוסים מתוארים בקצרה להלן.

טכנולוגיה כרומטוגרפית מתייחסת לשימוש ברכיבים שונים וזיקת פאזה נייחת או הבדלי אינטראקציה, כדי להשיג הפרדה של רכיבים שונים. כטכנולוגיה מתקדמת לייצור מוצרי דם, לכרומטוגרפיה עצמה יש אפקט של הסרת וירוסים, בעיקר כרומטוגרפיה זיקה וכרומטוגרפיה של חילופי יונים. עבור כרומטוגרפיה של חילופי יונים, לאלוציה יש יתרונות על פני חדירה בהסרת וירוסים. טבלה 2 מציגה את הנתונים הסטטיסטיים של קצב הסרת HAV על ידי טכנולוגיה כרומטוגרפית בתהליך ייצור אלבומין על ידי CSL Company באוסטרליה. כפי שניתן לראות מטבלה 2, כרומטוגרפיה של חילופי יונים וסינון ג'ל יעילים יותר בהסרת HAV, עם קצב הסרה כולל של 10.9 לוג.

בייצור של FVIII, Baxter Healthare מבצעת כרומטוגרפיה של זיקה אימונולוגית באמצעות ג'לים שטופלו בנוגדנים נגד FVIII, שיכולים להסיר (4.2±0.1)Log ו-(5.3±0}.9)Log מכלל לא. וירוסים מצופים בשומנים כמו PPV ו-HAV, בהתאמה.

עבור כמה וירוסים עם קוטר משטח קטן, כגון HAV ו-parvovirus B19, סינון ננוממברנה הוא שיטת ההסרה היעילה ביותר. הוא מנצל את ההבדל בגודל בין חלבונים לוירוסים ואת ספיחת הנגיפים על ידי קרום המסנן כדי לבודד וירוסים. מחקר מעבדה נערך באתר אספקת הדם Sanquin בהולנד על הסרת וירוסים על ידי הוספת סינון ננו-ממברנה Planova 15N דו-שלבי אחד לתהליך ייצור קומפלקס פרוטרומבין. נמצא ששיעורי ההסרה של HIV, HAV ונגיפים אחרים עלו בדרגות שונות לאחר סינון ננוממברנה (ראה טבלה 3).

עם זאת, הבעיות הבאות עלולות להתרחש כאשר שיטה זו מיושמת בייצור תעשייתי: ראשית, בשל הצמיגות הגבוהה של המוצר ונוכחות חלבונים בקוטר גדול, גודל הנקבוביות של הממברנה שנבחר על ידי המסנן לא צריך להיות קטן מדי, ובכך להגביל את ההסרה של וירוסים בקוטר קטן כגון HCV; שנית, היציבות של בקרת גודל נקבוביות הממברנה בתהליך ייצור המסנן תשפיע על הסרת הנגיף. שלישית, כאשר פתח הממברנה הקטן מקוטר חלקיק הנגיף נחסם, קצב זרימת המוצר יופחת, מה שמשפיע על התשואה. לכן, בחירת הממברנות שתכונותיהן וגודל הנקבוביות שלהן מתאימים לצרכי המוצרים המעובדים היא גורם חשוב באם סינון הננוממברנה יכול להסיר וירוסים.

תחת הנחת היסוד של הבטחת איכות מקור הדם, תהליך ההשבתה וההסרה של הנגיף הוא אמצעי חשוב והכרחי להבטחת בטיחות מוצרי הדם. השימוש רק בתהליך אחד של וירוס מושבת אינו יכול להבטיח באופן מוחלט את בטיחות מוצרי הדם. על בסיס טכנולוגיית השבתת הנגיפים נוספה טכנולוגיית הסרת הנגיפים כגון כרומטוגרפיה וסינון ננופילם, קצב הרחקת הנגיף הוגבר מאוד, והשפעת השבתת הנגיף והסרת הנגיף שופרו משמעותית. נכון לעכשיו, אירופה הציעה בבירור שבתהליך הייצור של מוצרי דם, יש להשתמש לפחות בהשבתה והסרה אחת של וירוסים כדי להבטיח את בטיחות מוצרי הדם.

בסין, רוב יצרני מוצרי הדם משתמשים בתהליך הייצור של וירוס מומת אחד בלבד, כמו שיטת חיטוי פסטר, שיטת S/D וכו', אך לא משתמשים בתהליך הסרת הנגיף, הפוגע בצורה רצינית באיכות מוצרי הדם. עם הצטרפותה של סין ל-WTO, תהליך הייצור ותקני האיכות של מוצרי דם מקומיים יהיו בקנה אחד עם העולם, אחרת, היא לא יכולה להבטיח את נתח השוק המקומי הקיים, אך גם לא תוכל להתחרות במוצרים דומים במדינות אחרות. שוק בינלאומי.

לפיכך, על יצרני מוצרי הדם בסין לשפר את תהליך הייצור, לחזק את השבתה והסרה של הנגיף, על מנת להבטיח באופן מלא את איכות ובטיחות המוצר. לכן, זו תהיה המגמה של יצרני מוצרי דם סיניים להשתמש בכרומטוגרפיה כדי לטהר מוצרי דם ולהסיר וירוסים כדי להבטיח את בטיחות מוצרי הדם.

Guidling Technology הוא מיזם היי-טק לאומי המתמקד בביו-פרמצבטיקה, תרבית תאים, טיהור וריכוז של ביו-רפואה, אבחון ונוזלים תעשייתיים. פיתחנו בהצלחה מכשירי סינון צנטריפוגליים, קלטות אולטרה סינון ומיקרו סינון, מסנן וירוסים, מערכת TFF, מסנן עומק, סיבים חלולים וכו' העונים במלואם על תרחישי היישום של ביו-פרמצבטיקה, תרבית תאים וכן הלאה. הממברנות ומסנני הממברנות שלנו נמצאים בשימוש נרחב בריכוז, מיצוי והפרדה של סינון מקדים, מיקרו-פילטרציה, אולטרה-פילטרציה וננו-סינון. קווי המוצרים הרבים שלנו, החל מסינון מעבדה קטן וחד פעמי ועד למערכות סינון ייצור, בדיקות סטריליות, תסיסה, תרבית תאים ועוד, עונים על צורכי הבדיקה והייצור. Guidling Technology מצפה לשתף פעולה איתך!

זוג: תהליך טיהור במורד הזרם של חיסון נגד שלשול חזיר

הבא: מנגנון ובקרה על זיהום ממברנות אולטרה-פילטרציה